产品简介
EasyGeno单片段重组克隆试剂盒基于DNA序列同源性进行片段重组，可快速将单个片段定向克隆到任意线性化载体中。通过精心设计和严格试验，本试剂盒含有的2×EasyGeno Single Assembly Mix具有的酶活性可将载体和片段的同源区域从双链的3’端进行重组连接，终得到的无缺口闭环质粒可直接转化感受态细胞筛选克隆。该方案克服了酶切位点的限制，仅需在插入片段PCR引物5’端引入线性化载体的末端序列，使得插入片段5’和3’两端带有载体两端的致性序列（15-25 bp），即可实现插入片段的定向重组进入载体。重组反应可在恒温条件下快速进行（50 ℃处理15 min），配合灵活的PCR产物处理方式和快速转化方法，数小时内即可完成从DNA样品准备到重组产物的转化涂板培养的全部操作。
产品特点
1. 无需考虑酶切位点限制，通过序列同源性15 min实现载体与片段的快速重组。
2. 插入片段的PCR产物正确且单，无需纯化，可直接与载体进行重组反应。
产品简介
EasyGeno单片段重组克隆试剂盒基于DNA序列同源性进行片段重组，可快速将单个片
段定向克隆到任意线性化载体中。通过精心设计和严格试验，本试剂盒含有的2×EasyGeno
Single Assembly Mix具有的酶活性可将载体和片段的同源区域从双链的3＇端进行重组连接，
终得到的无缺口闭环质粒可直接转化感受态细胞筛选克隆。该方案克服了酶切位点的限
制，仅需在插入片段PCR引物5＇端引入线性化载体的末端序列，使得插入片段5＇和3＇两端带
有载体两端的致性序列（15-25 bp），即可实现插入片段的定向重组进入载体。重组反应
可在恒温条件下快速进行（50℃处理15 min），配合灵活的PCR产物处理方式和快速转化方
法，数小时内即可完成从DNA样品准备到重组产物的转化涂板培养的全部操作。
产品特点
1. 无需考虑酶切位点限制，通过序列同源性15 min实现载体与片段的快速重组。
2. 插入片段的PCR产物正确且单，无需纯化，可直接与载体进行重组反应。
3. 可以选择性进行5 min快速转化E.coli感受态细胞。
4) 向转化体系中加入200 μl 无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素）混匀。混匀后，吸取
200 μl已转化的感受态细胞直接加到含相应抗生素的SOB或LB固体琼脂培养基上，用无
菌的平板涂布玻璃珠（GB101）或涂布棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至
液体被吸收，倒置平板，37℃培养6-9 h。
注意：对于氨苄青霉素抗性的载体，混匀后直接涂板。对于硫酸卡那霉素抗性或其他抗
性的载体，37℃摇床中180 rpm振荡培养45-60 min后，吸取100-200 μl进行涂板。
检测
1. 常规检测：将得到的菌落接种1-5 ml LB（含有相应浓度抗生素）培养基，37℃摇床振荡
培养过夜，保存菌种后提取质粒，应用PCR或酶切方法鉴定插入片段是否正确。
Control Insert DNA的PCR鉴定，请参考以下反应条件：
95℃ 2 min
94℃ 30 sec
55-65℃ 30 sec 30 cycles
72℃ 1 kb/min
72℃ 5 min
4℃ ∞
注意：检测引物的退火温度基于引物自身序列而定，并建议使用载体引物进行检测，
PCR延伸时间建议1 kb/min。
2. 快速检测：挑取菌落直接进行PCR检测（具体方法见分子克隆第三版）。
3. 测序鉴定：使用常规或快速方法进行初步的鉴定后进行序列的测定。
向感受态细胞悬液中加入5-10 µl重组产物（100 µl的感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒
DNA所饱和），轻弹混匀，在冰浴中静置30 min。
注意：所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之。以下实验以50 μl感受态
细胞为例。
3) 将离心管置于42℃水浴中放置60-90 sec，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3
min，该过程不要摇动离心管。
4) 向每个离心管中加入350 µl无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)， 混匀后置于37℃摇床
振荡培养45 min（180 rpm），目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
5) 将转化体系混匀，吸取100 μl已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的SOB或LB固体琼
脂培养基上，用无菌的平板涂布玻璃珠（GB101）或涂布棒轻轻的将细胞均匀涂开。将
平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16 h。
注意：如若基于以往经验克隆数较少，可将菌液4000 rpm离心10 min收集菌体，弃去培
养基，加入100-200 μl的SOC或LB培养基重悬菌体，并转移至含相应抗生素的SOB或LB
固体琼脂培养基上均匀涂开。
感受态菌落的生长速度取决于菌株的种类、所转化质粒的种类及所携带的抗性基因。
(2) 快速转化流程
1) 取T-Fast感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管
中，置于冰浴中。
注意： 次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl，可以根据实际情况分装使用。
2) 待感受态完全融化以后，向感受态细胞悬液中加入5-10 µl重组产物（100 µl的感受态细胞
能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻轻混匀，不要涡旋，并在冰浴中静置2 min。
注意：所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之。以下实验以100 μl感受
态细胞为例。
3) 将转化体系于42℃水浴中放置90 sec，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2 min，
该过程不要摇动离心管。
注意事项 请务必在使用本试剂盒之阅读此注意事项
1. 对于单个片段的PCR产物进行重组时，如果PCR条带单，可以直接进行重组反应，加
入体积不要超过重组体系的20%，重组效率要低于使用纯化后的PCR产物进行重组。
2. 如果想保留酶切位点进行后续的鉴定，建议增加缺失的酶切位点序列。
操作步骤
1. 线性化载体的制备
质粒的线性化不彻底将导致阴性克隆的产生，所以般建议通过双酶切或PCR扩增的方
法进行质粒的线性化，然后通过胶回收的方法回收纯化载体。对于以质粒模板进行扩增的
PCR产物，建议使用DpnⅠ内切酶消化残存的质粒模板。
2. PCR产物的准备
PCR产物的扩增建议使用高保真性聚合酶，如Pfu DNA polymerase (EP101)，Ultra
HiFidelity PCR Kit (KP203)等。
（1）进行插入片段克隆的引物设计原则
线性化载体的末端可以是酶切得到的平末端（图2a）、3’突出末端或5’突出末端（图
2b），或者是PCR得到的平端类型（图2a）。在引物设计时，遵循的原则是同源区域序
列的选择与载体的3’末端序列对齐为准，例如，酶切位点产生得到5’突出末端，以另外
条链3’ 端得到的序列开始计算出15 nt的长度作为同源序列。正向引物为与载体左臂重叠
区域（15-25 nt）加上基因插入片段正向序列（22 nt左右），反向引物为与载体右臂重叠
区域（15-25 nt）加上基因插入片段反向序列（22 nt左右）。