类器官是能够在体外三维培养，并表现出相应器官生物学特征的“最小系统”。虽然许多类器官的培养方案日渐成熟，但在实际操作中总会碰到这样那样的问题，今天小编整理了一些类器官培养操作中常遇到的问题，希望能够对各位小伙伴有所帮助。

Q1: 按照文献方法进行类器官培养，为什么观察到的形态却和文献不一致？

A1:决定类器官形态的因素有很多，样本来源是否相同、选用的细胞因子品质是否有差异都有可能改变最终的类器官形态。这里举一个文献中的例子，分别取四个高级别浆液性（HGS）卵巢癌患者的肿瘤组织，用同样的条件进行类器官培养，H&E染色结果显示它们的形态千差万别^【1】。因此对于类器官的鉴定，我们不能局限于形态观察，需要使用多种方法相结合。

图1. 由4例HGS卵巢癌患者的肿瘤组织所制备的类器官形态不同^【1】

Q2：类器官的药敏实验中需要使用DMSO作为药物的溶剂，需要控制DMSO的用量吗？

A2：考虑到DMSO这类有机物的细胞毒性，建议终浓度不超过0.1%（v/v）。

Q3：培养过程中发现类器官培养物中有黑色小颗粒，这个是杂质吗？应该怎样去除？

A3：黑色小颗粒大概率是杂质或细胞碎片，去除它们有以下两种方式可以参考：

1、将类器官消化下来，用培养基进行反复清洗，达到稀释杂质的作用；

2、用无菌手术刀将类器官切成两半，取1ml注射器吸满培养基并轻轻推出，冲洗类器官中的杂质^【2】。

Q4：对于肿瘤患者的个性化医疗测试，PDO、PDX、PDXO的模型可以相互结合使用吗？

A4：PDO、PDX、PDXO模型有各自的优势，通常有以下两种结合方式：PDO-PDX和PDX-PDXO。

1、PDO-PDX是性价比更高的方式，即：先利用PDO进行高通量的药物筛选，筛选出有效的药物再进行PDX测试。

2、PDX-PDXO是更精准的药物测试方式，即：先利用PDX产生大量的体内肿瘤，然后将这些肿瘤分离进行PDXO培养，此时可以通过PDX模型，将PDXO的药敏实验结果与体内用药结果一一对应，进而预测人体用药的结果，实现对患者更精准的用药指导；并且可以用PDX模型将转移后的肿瘤分离，同样进行PDXO培养和用药，能够更精确地对转移灶进行药物筛选。

Q5：类器官怎么从基质胶中回收？

A5：1、将类器官放置在冰上，待基质胶融化后离心进行回收，这种方式适用于不需要将类器官结构完全打散的情况；

2、市售的细胞回收液，可以温和有效地获得细胞悬液，不会损伤细胞或细胞表面蛋白。

Q6：为什么用基质胶来培养类器官？可以用其它类型的凝胶替代吗？

A6：基质胶能够为类器官提供支撑作用，目前类器官培养用的基质胶来源于小鼠肉瘤的基底膜基质，其中含有约60%层粘连蛋白、30% IV 胶原和8%的巢蛋白，还含有基底膜聚糖、TGF-ß、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、组织纤溶酶原等1800多种独特的蛋白质。由于基质胶中各因子的不确定性，并且存在批次间差异，因此目前也有一些聚焦于基质胶替代方案的研究，如图2^【3】。

图2.基质胶的三种替代方案^【3】。（a）去细胞外基质和其他衍生蛋白质，（b）合成水凝胶，以及（c）工程重组蛋白凝胶

Q7：怎样确定某一种类器官的培养方式更适用于基质胶包埋法还是气-液交互法呢？

A7：1、根据所模拟的器官自身生长情况选择，例如：皮肤的正常生长是有一面需要接触空气，那么对于皮肤类器官的培养倾向于利用气-液交互法来培养^【4】；

2、考虑所培养的类器官模型的应用方向，例如：气-液交互法培养易于进行病毒感染实验，因此用于病毒感染实验的气道类器官会优先选择气-液交互法培养^【5】。

Q8：在进行药敏实验前，类器官的接种方式是怎样的呢？

A8：药物筛选前，通常将类器官吹散后，用含2%-5%基质胶的培养基悬浮，并最终铺在基质胶包被的孔板中^【6-7】。

Q9：在离心回收时，会有很多类器官粘附在离心管壁，有没有更好的办法提高回收率？

A9：建议采用水平转子代替角转子，可以有效减少类器官挂在离心管壁的情况。

Q10：利用肿瘤类器官模型进行筛选的药物有什么局限性吗？

A10：1、抗体药物因为需要免疫细胞的参与，因此肿瘤类器官不能筛选抗体类药物，此类药物筛选需要构建肿瘤类器官-肿瘤微环境的模型来实现；

2、由于肿瘤类器官中没有对血管进行培养，因此抗血管类的药物也同样不能进行筛选。

以上就是小编总结的类器官应用相关的10个问题，各位小伙伴还遇到过其它的问题吗？欢迎大家在留言区提问，小编会一一回答您们的问题哦！此外，欢迎各位扫码添加近岸小助手二维码，加入类器官培养交流群，在这里会有专业的技术支持人员帮您解惑答疑，也将定期分享类器官前沿进展，让类器官培养更简单！

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参考文献

【1】Kopper, O. et al. (2019). An organoid platform for ovarian cancer captures intra-and interpatient heterogeneity. Nature medicine, 25(5), 838-849.

【2】MILLER, Alyssa J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature protocols, 2019, 14.2: 518-540.

【3】Kozlowski, M. T. et al. (2021). Towards organoid culture without Matrigel. Communications biology, 4(1), 1-15.

【4】Gangatirkar, P. et al. (2007). Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nature protocols, 2(1), 178-186.

【5】Mulay, A. et al. (2021). SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. Cell reports, 35(5), 109055.

【6】Van de Wetering, M. et al. (2015). Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell, 161(4), 933-945.

【7】Hirt, C. K. et al. (2022). Drug screening and genome editing in human pancreatic cancer organoids identifies drug-gene interactions and candidates for off-label therapy. Cell genomics, 2(2), 100095.