小编常常收到老师们的问题：我想做测序，我想做蛋白组学……但是我的样本不够啊，不符合你们的送样标准，这可怎么办!!!!
别着急小编今天就给大家介绍两种绝对定量测序：UMI mRNA-seq和UMI miRNA-seq，完美解决样本量不够的问题，顺便还能得到比常规测序更精准的结果，大家一起来了解一下。
什么是绝对定量测序
UMI(Unique Molecular Identifier)分子标记则通过随机性利用不同的分子标签，标记和区分不同的分子。绝对定量转录组测序（UMI-seq）通过在文库扩增前为每一条逆转录的 cDNA 添加的分子标签UMI，使同一个片段扩增出来的产物均带有相同的标签，天然重复片段则带有不同的标签。利用 UMI 过滤数据，可一比一准确还原样本初始状态。UMI标记测序的结果与Q-PCR检测结果一致性高，甚至对于低丰度表达的基因也能较准确的测出
UMI 标记方式示意图[1]
被随机分子标签标记的 cDNA 分子，在PCR扩增、建库测序及后续分析过程中都携带着这个独特的 UMI 标签。分析的时候计数 UMI 的个数，通过去重的办法去掉由于PCR偏好性多余扩增的UMI分子数，可以完美还原原始组成中不同RNA分子的比例，可实现原始RNA 分子的 “绝对定量”。
UMI绝对定量示意图
绝对定量测序（UMI-seq）的产品优势
一、更低的样本量，建库起始量低，mRNA-seq只需50ng，miRNA-seq只需200ng的Total RNA就能顺利进行mRNA/small RNAseq，更适合量少与珍贵样品；
二、更准确的定量分析结果，差异基因与Q-PCR验证一致性更高,极大缩短实验目标筛选时间。据文献报道，普通RNA-seq和miRNA-seq与Q-PCR验证的相关性为70%和35%，使用UMI建库，相关性可以达到80%以上；
Q-PCR法测定已知量UMI与实际测试UMI量的相关性[3] Q-PCR验证UMI miRNA差异基因分析[3]
三、更稳定的定量分析结果，避免低丰度基因丢失，可为致病及易感基因筛选等提供精准分析；
普通文库实际定量与模拟定量计算的相关性和稳定性[2] UMI文库实际定量与模拟定量计算的相关性和稳定性[2]
四、可区分天然重复和扩增重复的区别，准确识别可变剪切事件。
绝对定量测序（UMI-seq）测序方案
测序平台：illumina Novaseq 6000
测序模式：PE150
绝对定量测序（UMI-seq）生信分析内容
UMI mRNA-seq分析流程
UMI miRNA-seq分析流程
绝对定量测序（UMI-seq）的应用范围
比较转录组
要求精准的序列信息，从表达水平反应转录组进化的动态变化，并寻找潜在的驱动基因变化。
个体机制
要求准确的mRNA、smallRNA差异基因分析，构建miRNA及其靶基因的相关调控网络。
互作转录组
寄生类RNA表达丰度较低，可通过增加PCR循环次数提高检出率同时保证准确性。
生物标志物
适用于起始量较低或者富集较困难样本。
【参考文献】
1.S. Mangul, et al. UMI-Reducer : Collapsing duplicate sequencing reads via Unique Molecular Identifiers. bioRxiv, 2017 pp. 1–11.
2.Katsuyuki Shiroguchi, Tony Z. Digital RNA sequencing minimizes sequence dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. PNAS. 2012, 109: 1347-1352.
3.Pieter Mestdagh,Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control(miRQC) study. Nature Methods. 2014, 29.