病原体引起的传染病严重影响人类健康，据统计每年因传染病失去生命的人占总死亡人口的25%。自2020年新冠疫情爆发以来，全世界都笼罩在疫情的阴霾之下。因此在突发性传染病爆发时，能够快速检测识别病原体对遏制疫情扩散与疾病的治疗至关重要[1-3]。
主流的病原体检测方式大多基于免疫学（如：ELISA）或聚合酶链式反应（PCR）原理，但是在突发性传染病爆发时，制备有效的抗体所需周期较长，而基于PCR的检测手段对设备要求较高，在一些物资匮乏的地区难以第一时间配备设备，错过最佳防控时机[4, 5]。
CRISPR技术在作为继ZFN和TALEN之后的第三代基因编辑技术，在各个领域大放异彩。在体外诊断方面由于CRISPR/Cas9系统对靶标序列的精准识别，造就了基于此原理的新型生物传感器优良的检测性能。
基于CRISPR/Cas9系统的分子诊断大致可分为两类，一是基于切割功能的检测方法，另一种是基于定位功能的检测方法。
(一)基于切割功能的检测手法
NASBA-CRISPR Cleavage(NASBACC)技术
Cas9仅在具有PAM序列的情况下才具有切割能力，而任何随机突变都有48%的概率创造一个新的PAM位点或者破坏现有的PAM位点，因此可以利用特异性的PAM位点来区分菌株的谱系。
NASBA-CRISPR Cleavage(NASBACC)[6]将依赖核酸序列的扩增技术NASBA、toehold开关RNA传感器和CRISPR/Cas9系统进行结合，在特异性PAM序列和gRNA靶点的存在下，NASBA反应合成的双链DNA被Cas9切割，截短的RNA产物中缺少传感器H，所以无法激活toehold开关。而在没有PAM序列的情况下，就可以产生包含传感器H触发序列的全长RNA产物，从而激活传感器H。然后RBS和起始密码子被释放，激活LacZ基因翻译表达β-半乳糖苷酶，该酶可将黄色底物（氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷）转化为紫色产物（氯酚红），从而实现肉眼可见的颜色变化。近岸蛋白的NLS-Cas9 Nuclease（E365）可有效对双链DNA进行切割，适用于体外剪切靶DNA的特异位点。
图1. NASBA-CRISPR 技术检测原理[6]
CASLFA技术
Wang X等[7]将Cas9介导的检测技术整合至侧流层析试纸条(Lateral flow detection，LFD) ，建立了新型的比色生物传感系统CASLFA (CRISPR/Cas9- mediated lateral flow nucleic acid assay)。在这个体系中，利用生物素标记的引物对靶标DNA进行扩增，将扩增产物添加到反应体系后，Cas9/sgRNA会特异性识别靶标DNA并形成三元复合物。随后将反应底物滴加至侧流层析试纸条上，在毛细作用下，液体不断地向前流动。当复合物流经结合垫时，AuNP-DNA探针会与sgRNA的环状区域结合，形成四元复合物，随后被固定在检测线的链霉亲和素捕获，而过剩的AuNP-DNA会继续向前流动并被质控线上的探针捕获。由于AuNP的积累，会在检测线与质控线上产生颜色带，通过显色即可判断靶DNA是否存在。近岸蛋白的Cas9 (D10A, H840A) Nuclease（E368）在Cas9 Nuclease基础上突变两个切割活性中心，使其只具有靶DNA结合活性，但无切割活性，可有效应用于Cas9/sgRNA与目的DNA的特异性结合。
图2. CASLFA技术检测原理[7]
CAS-EXPAR技术
Cas9/sgRNA复合物对ssDNA底物进行定点切割，生成产物片段（X）。通过DNA聚合酶催化X与EXPAR模板杂交，得到双链延伸产物。双链产物随后被NEase切割形成缺口，X的一个拷贝被Vent（外）DNA聚合酶从模板上释放出来，解离的X继续触发新一轮的扩增反应[8]。近岸蛋白的Cas9（D10A）Nickase（E366）在Cas9 Nuclease基础上突变其中一个切割活性中心，其能够在与sgRNA靶序列互补的单链DNA上产生切口，从而形成功能性的单链断裂。
图3. CAS-EXPAR技术检测原理[8]
(二)基于定位功能的检测方法
Paired dCas9(PC)技术
Paired dCas9(PC)技术是使用一对dCas9蛋白，分别融合荧光素酶的两个分离结构域（NFluc和CFluc），并通过两个靶向相邻序列的gRNA实现检测。其反应原理如图4所示：当存在靶标DNA时，两个分别带有荧光素酶结构域的dCas9在gRNA的引导下结合到相邻的靶标序列上，荧光素酶的两个分离结构域相互靠近，形成有活性的荧光素酶，在ATP和氧气存在条件下，催化荧光素氧化，生成氧化荧光素，并产生可检测的荧光信号[9]。
图4. Paired dCas9(PC)技术原理[9]
dCas9/sgRNA-SG I DNA-FISH
Guk K等基于SYBR GREEN I荧光染料开发了dCas9/sgRNA-SG I DNA-FISH系统：即通过设计识别靶标基因的sgRNA序列，dCas9/sgRNA复合物能够特异性识别靶标基因并形成三元复合物。由于dCas9蛋白带有His标签，所以利用anti-His磁珠可以将三元复合物分离，最后加入SYBR GREEN I与体系中的靶标DNA结合实现可视化检测[10]。
图5.dCas9/sgRNA-SG Ⅰ DNA-FISH技术原理[10]
总结与展望
基于CRISPR/Cas9的新型体外检测手段可以对多种病原微生物进行高效精准检测。相较于传统的检测手段，CRISPR/Cas9类的生物传感器大都不需要大型精密的仪器，对检测场地没有苛刻的要求，大大地降低了检测的成本。除此之外，将CRISPR/Cas9系统与其他技术相结合，也能够大大提高检测的灵敏度与普适性。
基于CRISPR/Cas9的检测手段在一些方面有着巨大优势，但是在病原体检测领域依然有着不可避免的局限性，比如上述的NASBA-CRISPR cleavage技术，Cas9只能对靶标序列进行切割，一旦靶标序列浓度过低，就会由于产物颜色过浅而无法读取准确的实验结果；Cas-EXPAR检测步骤过多，所需试剂过于复杂。虽然该技术正处于起步阶段，全面超越传统的检测方法仍存在一定距离，但随着研究的不断深入，我们有望开发出更多类型的CRISPR/Cas体系，将它们更广泛地应用在病原微生物的检测中。
参考文献
[1] Broughton J P, Deng X, Yu G, et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2 [J]. Nat Biotechnol, 2020, 38(7): 870-874.
[2] Wang X, Zhong M, Liu Y, et al. Rapid and sensitive detection of COVID-19 using CRISPR/Cas12a-based detection with naked eye readout, CRISPR/Cas12a-NER [J]. Sci Bull (Beijing), 2020, 65(17): 1436-1439.
[3] Smyrlaki I, Ekman M, Lentini A, et al. Massive and rapid COVID-19 testing is feasible by extraction-free SARS-CoV-2 RT-PCR [J]. Nat Commun, 2020, 11(1): 4812.
[4] Lequin R M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [J]. Clin Chem, 2005, 51(12): 2415-2418.
[5] Li Z, Zhang X, Hu X, et al. Development of an indirect ELISA assay for detecting antibodies against mammalian reovirus in pigs [J]. J Virol Methods, 2018, 262: 61-64.
[6] Pardee K, Green A A, Takahashi M K, et al. Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components [J]. Cell, 2016, 165(5): 1255-1266.
[7] Wang X, Xiong E, Tian T, et al. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9-Mediated Lateral Flow Nucleic Acid Assay [J]. ACS Nano, 2020, 14(2): 2497-2508.
[8] Huang M, Zhou X, Wang H, et al. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 Triggered Isothermal Amplification for Site-Specific Nucleic Acid Detection [J]. Anal Chem, 2018, 90(3): 2193-2200.
[9] Zhang Y, Qian L, Wei W, et al. Paired Design of dCas9 as a Systematic Platform for the Detection of Featured Nucleic Acid Sequences in Pathogenic Strains [J]. ACS Synth Biol, 2017, 6(2): 211-216.
[10] Guk K, Keem J O, Hwang S G, et al. A facile, rapid and sensitive detection of MRSA using a CRISPR-mediated DNA FISH method, antibody-like dCas9/sgRNA complex [J]. Biosens Bioelectron, 2017, 95: 67-71.
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