TUNEL 法测凋亡操作步骤-其它资料-资讯-生物在线

TUNEL 法测凋亡操作步骤

作者:上海远慕生物科技有限公司 2015-08-13T00:00 (访问量:7653)

 TUNEL 法测凋亡操作步骤

                            Yuanmu

 

一、TUNEL检测原理

      TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA 的断裂情况,可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)的凋亡原位检测。

     其原理是细胞凋亡发生时,内源性核酸酶激活,使DNA的双链断裂或一条链出现缺口,产生一系列3’-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下,组织细胞原位DNA切口可被标记上生物素-dUTP,即TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling),可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)特异结合,在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺(DAB)的存在下,显示为棕色(过氧化物酶活性),特异准确地定位正在凋亡的细胞,在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞;由于正的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂,因而没有3'-OH 形成,很少能够被染色。

二、试剂盒组份

       组   份          10 assays             25 assays               储存条件

A:Equilibration Buffer                           1.0 mL                  2.5 mL                    -20 ℃          

B:Biotinylated Nucleotide Mix               10 μL                    25 μL                     -20 ℃

C:TdT Enzyme                                    10 μL                    25 μL                     -20 ℃          

D:500×Proteinase K                      10 μL                    25 μL                     -20 ℃

       20×SSC                                       15 mL                   38 mL                     4 ℃

E:Streptavidin-HRP                              10 μL                   25 μL                       4 ℃

F:20×DAB Substrate Buffer                 50 μL                  125 μL                    4 ℃           

G:20×DAB Chromogen                       50 μL                  125 μL                   4 ℃

H:20×Hydrogen Peroxide                    50 μL                  125 μL                   4 ℃

三、操作流程

1.操作流程概览

 

2.细胞样本制备

准备:

    ● PBS:8.0g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4,溶于800ml去离子水中,HCl调pH至7.4,加水定容至1L。

    ● 固定液:4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中,新鲜配制;

    ● 封闭液:3%H2O2溶于甲醇;

    ● 细胞膜通透液:0.1%TritonX-100溶于PBS,新鲜配制;

操作步骤:

1)经过实验处理的细胞爬片或细胞涂片,自然晾干;

2)室温固定15min~30min;PBS漂洗3×5min;

3)浸入封闭液中,室温封闭10min;PBS漂洗3×5min;

4)浸入细胞膜通透液中,室温30sec~2min;

5)进行标记反应。

3.石蜡包埋组织切片预处理

准备:

    ● 石蜡切片脱蜡至水:二甲苯脱蜡2×10min,梯度乙醇水合(100%、95%、90%、80%、70%);

    ● 蛋白酶K工作液:2 μL500×蛋白酶K + 998 μL PBS;

    ● 固定液:4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中,新鲜配制;

    ● 封闭液:3%H2O2溶于甲醇。

操作步骤:

1)石蜡包埋的组织切片按常规方法脱蜡至水;

2)PBS漂洗3×5min;

3)加入蛋白酶K工作液,37℃反应15~30min;PBS漂洗3×5min;

4)(选择进行)室温固定15min~30min;PBS漂洗3×5min;

5)浸入封闭液中,室温封闭10min,PBS漂洗3×5min;

6)进行标记反应。

4.冰冻组织切片预处理

准备:

    ● 固定液:4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中,新鲜配制;

    ● 封闭液:3%H2O2溶于甲醇;

    ● 细胞膜通透液:0.1%TritonX-100溶于PBS,新鲜配制;

操作步骤:

1)冰冻切片浸入固定液,室温固定10min;PBS漂洗3×5min;

2)浸入封闭液中,室温封闭10min;PBS漂洗3×5min;

3)浸入通透液中,室温30sec~2min;

4)进行标记反应。

5.阳性对照和阴性对照的准备

TUNEL检测时需要设立阳性对照和阴性对照,以显示实验的客观性和准确性。

1)阳性对照样本的处理(选择进行)

   DNaseI反应液(用户自备): (10U-3000U DNase I;40mM Tris-HCl pH 7.9; 

                                                   10 mM NaCl;6mM MgCl2;10mM CaCl2)

组织样本经过蛋白酶K处理或者通透液处理,PBS浸洗后,加入100 μL DNaseI反应液,室温孵育10~30min,用去离子水彻底清洗玻片,浸入PBS漂洗5min,进行标记反应。

2)阴性对照样本的处理

   在进行标记反应过程配制TdT酶反应液时,不加入TdT酶,其余步骤相同。

四、标记和显色反应

以下操作在湿盒内进行。

1.预处理好的样本经过PBS漂洗后,用滤纸轻轻吸去样本周围液体;

2.每个样本滴加100 μL TdT酶反应液,于37C避光反应60min;

TdT酶反应液的准备(即用即配):

  成分                                        标准100 μL/片        切片数        总体积

  Equilibration Buffer                    98 μL                     ×                =

  Biotinylated Nucleotide Mix        1 μL                      ×                =

  TdT Enzyme                             1 μL                      ×                =

阴性对照片不加TdT酶。

3.用去离子水按1:10稀释20×SSC,进行终止反应,室温15min;然后PBS漂洗3×5min;

4.浸入0.3%H2O2/PBS中封闭内源性过氧化物酶活性,室温孵育3~5min;PBS漂洗3×5min;

5.滴加100 μL Streptavidin-HRP工作液(按1:500稀释为工作液),于37℃反应30~60min;

6.PBS漂洗3×5min;

7.滴加DAB显色液:

  成分                                         100 μL/片       切片数     总体积

  20×DAB Substrate Buffer             5                   ×             =

  20×DAB Chromogen                    5                   ×            =

  20×Hydrogen Peroxide                 5                  ×            =

  ddH2O                                        85                  ×            =

8.用去离子水漂洗数次;(选择进行复染细胞核);

9.中性树胶封片,显微镜下观察。

注意事项:

1.PBS清洗后,请尽量去除PBS液体再进行下一步反应;

2.避免载波片上的样本干燥造成实验失败;

3.TdT酶反应液应即用即配,在冰上进行,不宜长期保存;

4.复染细胞核可以用甲基绿染液(用户自备)。

 

参照图

上海远慕生物科技有限公司 商家主页

地 址: 上海浦东新区川沙经济园区

联系人: 俞燕熙

电 话: 021-58999639

传 真: 021-50760790

Email:m13310162040@163.com

相关咨询

各种生化分析检验系统介绍 (2017-05-08T11:28 浏览数:7933)

支原体染色检测试剂盒 (2017-01-06T16:26 浏览数:7147)

ELISA产品会出现的问题及解决办法 (2016-12-21T16:14 浏览数:6358)

远慕告知您ELISA最基本的操作原理! (2016-12-07T15:10 浏览数:12618)

远慕ELISA试剂盒实验原理和操作注意事项 (2016-10-26T16:22 浏览数:12435)

远慕生物介绍:常用电泳试剂 (2016-10-11T11:06 浏览数:6200)

远慕生物-鸡免疫球蛋白G试剂盒 (2016-09-23T09:39 浏览数:6225)

上海远慕:印度墨汁 (2016-09-07T10:20 浏览数:6878)

单细胞凝胶电泳标准操作 (2016-08-22T16:02 浏览数:12458)

胎牛血清质量该怎样辨别?看颜色就知道嘛? (2016-09-09T10:19 浏览数:8055)

ADVERTISEMENT