1、利用2合1策略制备具有稳健扩增能力的CD7 CAR-T细胞

作者首先构建了三种CD7 CAR-T细胞（3A1F、TH69及T3-3A1），并证明3A1F和TH69 CAR-T细胞在抗原刺激下表现出强大的细胞毒性和强劲的细胞因子分泌，但由于自相残杀而无法在体外扩增。以往研究表明通过基因编辑敲除CAR-T细胞表面的CD7和TCR，即制备不表达CD7的CAR-T细胞可以减少自相残杀，但实验方法均是用慢病毒或逆转录病毒制备CD7 CAR-T细胞，CAR基因的半随机整合可能会破坏正常基因的表达。此外，最近研究表明通过CRISPR/Cas9将CD19 CAR插入TRAC位点可减少CAR介导的tonic信号并增强肿瘤排斥反应。基于上述研究，作者开发了一种2合1策略，利用CRISPR/Cas9技术和AAV病毒载体（维真生物助力）通过同时敲除CD7和敲入CD7 CAR，将CD7 CAR直接插入CD7位点，生成了能够稳健扩增的CD7^KO&KIEF1α CAR-T细胞。随后比较了三类CD7^KO CAR-T细胞（CD7敲除的RV介导的CAR随机整合T细胞、CD7敲除的TRAC位点CAR特异性整合的T细胞及CD7^KO&KIEF1α CAR-T细胞）的体外效应功能。经分析，三种CD7^KO CAR-T细胞对Jurkat细胞系均具有相似的细胞毒性，并且均表现出强劲的细胞因子分泌，并对原代T-ALL细胞也表现出强大的效应功能。

2、两种位点特异性敲入CAR-T细胞在小鼠T-ALL异种移植模型中具有更强的保护作用

作者比较了三种CD7特异性CAR-T细胞的体内抗肿瘤功能，分别向T-ALL小鼠模型注射三种类型CAR-T细胞或未转导CAR的T细胞(1×10⁶  cells )，比较不同CAR-T细胞的效果。结果显示三种CD7 CAR-T细胞均可以延缓T-All的进展并延长小鼠的中位生存期，更具体来看，用位点特异性敲入CAR-T细胞(CD7^KOTRAC^KI或CD7^KO&KIEF1α细胞)治疗的小鼠比用逆转录病毒转导的CAR-T细胞治疗的小鼠显示出更长的中位生存期，并且CD7^KO&KIEF1α组的整体肿瘤根除率略优于CD7^KOTRAC^KI组。

3、利用2合1策略制备具有抗肿瘤活性的CAR-NK细胞

由于健康T细胞和恶性T细胞较难区分，在分离自体T细胞制造针对T细胞恶性肿瘤的CAR-T细胞时，易导致产品污染。NK细胞可以有效地从T细胞中分离出来，因此使用NK细胞能在很大程度上避免这一问题。但NK细胞也表达CD7，会导致CAR-NK细胞的自相残杀。因此作者试图使用2合1 CD7^KO&KI策略来设计CD7特异性的CAR-NK细胞。CD7^KO&KIEF1α CAR-NK细胞对Jurkat细胞表现出高效的细胞毒性以及强劲的细胞因子分泌。体内实验表明，CAR-NK具有有效的抗Jurkat肿瘤活性，并对难控制的CCRF-CEM肿瘤表现出强大的效应功能。上述结果表明将EF1α驱动的CD7 CAR插入CD7位点是一种可行的策略，在T细胞和NK细胞中均有效。

综上所述，作者开发了一种2合1敲除和敲入策略，通过在EF1α启动子的控制下，在CD7位点表达CD7 CAR，减少了CAR-T和CAR-NK细胞的自相残杀，增强了二者对T-ALL肿瘤的排斥反应。CD7^KO&KI经济有效且风险较低，是开发自体CD7特异性CAR-T细胞的可选策略。