研究背景

食管鳞状细胞癌是我国高发的癌症，占全球病例数的50%。目前食管癌早诊困难，70%的食管癌患者在初诊时已发展为局部晚期或转移性；预后较差，治疗后的5年生存率仍仅有20%~30%。食管癌的发生和演进是一个长期过程。异常的细胞克隆要经历包括低级别上皮内瘤变(low-grade intraepithelial neoplasia, LGIN)和高级别上皮内瘤变(high-grade intraepithelial neoplasia, HGIN)的癌前病变阶段，最终发展成侵袭性的食管癌。尽管食管鳞癌的癌前病变和侵袭性癌的组织病理学特征已很清楚，但推动癌变细胞向恶性表型演进的分子机制一直尚不明了。

一百多年前，Paget医生即提出肿瘤发生和转移的“种子土壤假说”，即上皮细胞的恶变和进一步的转移都依赖其周围的微环境“土壤”。与上皮细胞关系最紧密，数量最多的基质细胞是成纤维细胞，以往的研究已经证明，通过参与基质重塑和分泌多种细胞因子，成纤维细胞在肿瘤发生过程中发挥着重要作用。正常食管组织中，成纤维细胞和上皮细胞均能维持稳定状态，而在ESCC发生的癌前阶段，随着上皮细胞的一系列改变，成纤维细胞逐渐脱离正常的静息状态，激活为能推动肿瘤发生的肿瘤相关成纤维细胞。

研究结果

为了寻找ESCC发生过程微环境改变的原因，我们对ESCC发生过程中多阶段的食管上皮细胞进行了单细胞和空间转录组测序，描绘了食管鳞癌发生过程中上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞的变化（图1）。

接下来我们鉴定了八个与癌发生过程相关的上皮细胞表达Programs，包括quiescent progenitor (QP), cycling (CY), mucosal defense (MD), terminal differentiation (TD), hypoxia-related stress (HY), reactive oxygen species-related stress (RS), deoxidation (DO)和 antigen presenting (AP)（图1，图2）。我们发现其中的上皮细胞MD program（Mucosal defence program）会随癌变下降，且其中的关键基因ANXA1水平也随癌发生在上皮中显著表达下调（图2）。

之前实验室的研究已经发现了成纤维细胞是食管癌微环境的重要组成部分（Zhang et al,2021）¹，为了进一步寻找食管癌发生过程中上皮细胞与微环境之间的具体串扰关系，我们解析了食管癌发生过程中成纤维细胞的变化，发现存在三类正常成纤维细胞SLPI-Normal fibroblast，CCN2-Normal fibroblast, APOE-Normal fibroblast,和两类癌症相关成纤维细胞iCAFs和myCAFs并描绘了他们之间的演进关系（图3）。

我们计算了上皮细胞多种Program的打分与成纤维细胞水平之间的关系，发现MD program水平与微环境中的成纤维显著负相关。相应结果在空间转录组中也得到了验证。

接下来，我们在蛋白水平验证了MD program相关基因ANXA1会随着食管癌的发生显著下降，并且与微环境中成纤维细胞的激活转化高度负相关，在食管癌发生类器官模型中我们也验证了这一相关性。为了寻找这一现象背后的机制，我们构建了敲除和过表达ANXA1的上皮细胞，并进行了人原代正常食管成纤维细胞（NF）共培养和小鼠皮下共注射成瘤实验，发现上皮细胞中的AXNA1确实能维持正常成纤维细胞的静息与稳定，抑制癌细胞对其的驯化和激活，特别是抑制其向myCAF转化，从而降低活化成纤维细胞与myCAF的促食管癌变作用。通过重组蛋白和条件培养基处理的方式，我们发现这种维持作用是以分泌型ANXA1的方式发挥的（图4）。

之后，通过Co-IP、荧光共聚焦定位和受体Rescue实验，我们证明分泌型的ANXA1结合成纤维细胞表面的甲酰肽受体2（FPR2）从而维持成纤维细胞稳定状态并抑制成纤维细胞激活。TGF-β是促进正常成纤维细胞激活并转化为CAF中最主要也最关键的信号因子，通过食管类器官上清检测，我们发现食管癌变过程中会上皮细胞会分泌TGF-β，且其分泌量持续上升。我们猜想，ANXA1作为维持成纤维细胞静息状态的信号分子，是否与TGF-β的作用相拮抗？于是我们检测了成纤维细胞中TGF-β的信号下游和ANXA1的信号下游，我们发现前者会激活成纤维细胞中的ERK/AKT/SMAD3的磷酸化，并依赖这一信号通路活化成纤维细胞；而后者作用于FPR2后，会抑制这一信号通路的磷酸化，维持成纤维细胞的稳定状态。说明上皮细胞作为主导者，在癌变中既提供成纤维细胞活化的“动力”TGF-β，又减少了成纤维细胞“刹车”ANXA1的分泌，最终导致成纤维细胞的恶性转变（图5）。

之后为了在体外验证这一结论，我们对4NQO诱导的自发小鼠ESCC模型给予Ac2-26这一ANXA1的功能肽药物处理，发现与对照相比，ANXA1的功能肽能有效延缓小鼠食管鳞癌的发生。

最后，我们希望寻找上皮细胞中ANXA1缺失的原因，首先我们计算了癌变过程中ANXA1的基因组CNV和甲基化水平变化，发现并没有发生显著改变，提示我们可能是调控ANXA1表达的转录因子发生了改变，通过数据库预测、RNAi、ChIP-qPCR、EMSA和双荧光素酶报告实验等手段，我们发现并证明了ESCC癌发生过程中上皮细胞转录因子KLF4的丢失是ANXA1下降的关键原因，最终会直接推动成纤维细胞的活化（图6）。

至此，我们证明了上皮细胞KLF4-ANXA1的逐步丧失及这种异常的上皮细胞与微环境之间的串扰是推动ESCC发生过程中的关键进程，为ESCC的精准防治提供了新的思路和方向。

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主要第一作者

陈亚玫，博士毕业于中国医学科学院肿瘤医院，目前在印第安纳大学韩冷课题组从事博士后研究工作。研究方向为致力于利用生物大数据研究癌症等复杂疾病的致病机理，整合多维度组学研究癌症的发生机制和药物反应。

祝世昊，现为中国医学科学院肿瘤医院博士研究生，师从林东昕院士。研究方向为解析食管癌发生过程上皮与微环境的串扰与共进化过程，寻找其中关键调控因素与其推动肿瘤发生的作用机制。

1. Zhang, X., Peng, L., Luo, Y., Zhang, S., Pu, Y., Chen, Y., Guo, W., Yao, J., Shao, M., Fan, W., et al. (2021). Dissecting esophageal squamous-cell carcinoma ecosystem by single-cell transcriptomic analysis. Nat Commun 12, 5291. 10.1038/s41467-021-25539-x.