PART1

细胞贴壁原理

大部分来自实体组织器官的细胞都会贴壁，但不是所有的细胞在体外培养的情况下都会贴壁。许多细胞必须添加促贴壁物质才能贴壁生长，促贴壁物质一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白和胶原蛋白等。

 细胞贴壁过程

细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面（如培养瓶、培养皿的底面）。细胞通过其表面的黏附因子与这些细胞外基质结合。所以细胞贴壁与否与细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与培养皿壁的表面结构和培养基中的黏附蛋白有关。

    细胞粘附分子

是众多介导细胞间或细胞与细胞之间相互接触和结合分子的统称。

    细胞外基质

是由动物细胞合并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。

二者大多数均为糖蛋白，因此具有较强的亲水性。因此细胞贴壁与否和细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与有无合适的底物（培养瓶）有关。大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长，在体外时这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。

PART2

胶原蛋白（Collagen）

胶原蛋白是支持细胞和组织生长的重要胞外基质蛋白，其形成的胞外环境有利于多种细胞的粘附、生长、迁移和分化。胶原主要包括I型胶原，Ⅱ型胶原，Ⅲ型胶原，Ⅳ型胶原，Ⅴ型胶原，Ⅵ型胶原几种。

I 型胶原—最常见的胶原蛋白，促进细胞的贴壁和增殖，用于内皮细胞，肝细胞，肌细胞等的培养。

软骨细胞对II型胶原的黏附性较好；上皮细胞在Ⅳ型胶原底物上贴壁良好，而在I、II、III型胶原底物的培养板上贴壁情况较差。胶原应用及建议细胞基质浓度。

表1.不同胶原蛋白包被浓度

PART3

纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）

细胞纤连蛋白（fibronectin，FN）是一种细胞外糖蛋白，分别以可溶形式存在于体液中，或以不可溶形式存在于细胞外基质中。作为主要的细胞粘附分子之一，FN 在许多重要的生理过程中起着关键性作用，如胚胎生成，伤口愈合，止血和血 栓形成。纤连蛋白表达的改变，降解以及组合与大量的病理发生密切相关，包括癌症和纤维化。

重组纤维连接蛋白，可作为一种细胞培养基质，替换Matrigel、鼠尾胶原、血源纤连蛋白等，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平，缩短细胞生长周期。也可直接添加到培养基中，替换或降低血清使用量，促进细胞贴壁、迁移、移动生长、维持细胞状态。

Human FN包被方法（以6孔板为例）

 01 

母液配制：用20mM 柠檬酸盐，250mM NaCl，pH7.2~7.4溶解重组人纤维连接蛋白(rFN)，建议配置  1mg/mL 的储存液。母液按照单次使用剂量，分装冻存于-20 ℃，避免反复冻融；

02 

取出适量的重组人纤维连接蛋白（rFN），用无菌1×PBS，pH 7.2~7.4稀释至工作液浓度，终浓度参考范围50~100 μg/mL。混匀后，加入到6孔板中，800μL/孔，保证工作液完全覆盖6孔板底部；

03 

将加有rFN工作液的6孔板，放置在4 ℃过夜或者37 ℃包被1 h；

04 

收集6孔板中的工作液，放置4 ℃保存，一周内可用于其他培养瓶/板包被；

05 

取出rFN包被后的6孔板，加入正常的细胞培养基后，可直接接种细胞，rFN促进细胞贴壁、生长等；

06 

若包被后的6孔板暂不使用，放置在4 ℃密封保存，建议一周内使用完。

【注】：包被/铺板实验中，重组人纤维连接蛋白（rFN）工作液的加入量，应根据培养皿/瓶的大小进行调整，请参见下表2。

表2. 重组人纤维连接蛋白包被浓度

PART4

玻连蛋白（Vitronectin）

玻连蛋白（Vitronectin），又称S-蛋白或血清扩散因子，是一种在肝脏中合成的分泌型糖蛋白，属于小分子蛋白，借由Vitronectin 受体让细胞贴附于细胞基质中，主要促进细胞迁移，增加细胞贴附性、细胞分裂、细胞生长分化等，并协助细胞间的讯号传递。

Human VTN蛋白包被方法

本方案仅作参考，具体包被条件需要根据细胞培养体系进行优化

 01 

取出重组人玻连蛋白，用无菌1×PBS，复溶至浓度0.1- 1 mg/mL。混匀后，用培养基稀释至5- 20μg/mL工作液浓度；

02 

根据实验所用培养器皿，参考下表3.建议的包被量进行包被。包被时，使包被液均匀覆盖在培养皿表面，37℃孵育1小时以上。37℃过夜包被，效果更佳；

03 

使用时，吸去培养容器表面的Human VTN工作液，将细胞直接接种到培养器皿中。

【注】：VTN的工作浓度与不同细胞系密切相关，请根据不同细胞系对VTN包被浓度进行适当调整。避免使用在4℃保存24小时以上的、配制好的VTN包被液进行包被。

表3. Human VTN 包被不同培养器皿的建议使用体积

PART5

层粘连蛋白（Laminin）

层粘连蛋白是细胞外基质的重要组成，存在于所有上皮细胞和内皮细胞的基底侧，同时也是某些细胞与细胞间交互作用的中间媒介。层粘连蛋白对于生物活性至关重要，影响细胞分化、生长、迁移和粘附等。层粘连蛋白是一种细胞外基质多结构域三聚糖蛋白，是基底层的主要非胶原成分，支持粘附、增殖和分化。层粘连蛋白由A、B1和B2链组成，这些链由许多二硫键连接。层粘连蛋白支持多种细胞类型的生长和分化，包括上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、肌肉细胞和肝细胞。Laminin 521已成为大规模扩增诱导多能干细胞 (iPSC) 最有前景的涂层系统。

Laminin 521一般使用步骤（仅供参考）：

 01 

用Laminin 521包被细胞培养介质（常见用量为0.5 μg/cm2，具体视实验而定）；

02 

清洗细胞，加入消化酶或EDTA孵育；

02 

分离成单细胞悬液，离心，并在合适的新鲜培养基中重悬；

04 

将细胞接种在已用Laminin 521包被的培养介质上。。

PART6

Poly-D-lysine 多聚-D-赖氨酸

和Poly-L-lysine 多聚-L-赖氨酸

Poly-lysine多聚赖氨酸，是一种带正电荷的氨基酸聚合物，包被在培养器皿表面，不仅能促进细胞的贴壁，还能加强对血清蛋白和细胞外基质蛋白的吸附，也可用作组织学分析的粘片剂。多聚赖氨酸分为D型和 L型。

Poly-D-lysine多聚-D-赖氨酸（PDL）和Poly-L-lysine多聚-L-赖氨酸（PLL）分子量为150000~300000，都可促进细胞的贴壁生长，最常用的浓度是0.1 mg/mL。2个产品的区别在于PDL不会被细胞吸收，但PLL可以被某些细胞吸收，摄入过多会产生一定的细胞毒性。

细胞培养一般步骤如下：

 01 

用PBS或者无菌水将poly-D-lysine或者poly-L-lysine配制成浓度为0.1 mg/mL的溶液后进行无菌过滤；

02 

将过滤后的poly-D-lysine/poly-L-lysine溶液倒入培养器皿，使用量为0.5~1.0 mL/25cm2，轻轻摇晃，使其均匀覆盖在培养器皿表面；

02 

5~10 min后，用移液器吸出溶液，用PBS清洗培养器皿表面；

04 

干燥2~3h后，可进行细胞培养。

PART7

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