研究背景：NK细胞在固有免疫和适应性免疫中均有重要的作用，Mn²⁺激活cGAS-STING通路，但该机制对NK细胞的影响尚不明确。

科学问题：Mn²⁺如何调控NK细胞的激活。

实验材料：C57BL/6小鼠、NK-92MI细胞系、人类和小鼠的原代NK细胞。

表型：Mn²⁺处理显著抑制小鼠黑色素瘤生长，且NK细胞在这一过程中受到Mn²⁺调控。

机制：Mn²⁺激活NK细胞中的cGAS-STING通路，激活UTX的表达，提升NK细胞的响应，直接增强NK细胞的细胞毒性和细胞因子分泌，并通过NK细胞间接激活CD8+ T细胞。

单细胞转录组测序

（技术服务由伯豪生物提供）

1. Mn²⁺的抗肿瘤效应依赖于NK细胞

作者通过向C57BL/6小鼠中注射小鼠黑色素瘤细胞B16F10，构建肿瘤模型，分四次腹腔注射MnCl₂，观察到Mn²⁺处理显著抑制肿瘤生长，NK细胞、CD8+T细胞等均有显著增加，NK细胞具有更强的抗肿瘤活性（Fig. 1A-D, S1A, B）。

为了探究Mn²⁺抗癌的主要影响因素，作者设计了Rag1全身性敲除（Rag1^-/-）的免疫缺陷性小鼠，阻断T细胞和B细胞的发育和分化。在排除了T细胞和B细胞的影响后，Mn²⁺的抗肿瘤能力依旧显著强于对照组，另一方面，Mn²⁺处理组中的NK细胞的激活水平也显著高于对照组（Fig. 1F, G）。在使用NK细胞抑制剂处理后，肿瘤生长显著上调，而Mn²⁺的抗肿瘤效应下调（Fig. 1H, I, J）。回补Mn²⁺，有部分CD8+ T细胞受到激活，肿瘤的生长因此受到部分抑制（Fig. 1I, J, K）。如上结果暗示了NK细胞在Mn²⁺介导的抗肿瘤效应中发挥的关键性作用，以及Mn²⁺在此过程中还可能通过NK依赖或非依赖的方式激活其他类型的免疫细胞。

2. Mn²⁺直接调控NK细胞的细胞毒性

考虑到NK细胞在清除肿瘤细胞过程中发挥的重要作用，作者选择小鼠胰腺和人类PBMC中分离纯化出来的NK细胞，用于探究Mn²⁺对NK细胞的细胞毒性的调控。结果表明，Mn²⁺处理不会对NK细胞的生长和凋亡产生显著性的影响，但能使得NK细胞激活marker的表达水平上调（Fig. 2A-F）。

随后，作者选取NK-92MI细胞系和人类原代NK细胞，与靶细胞K562分别以不同的细胞比例（E:T）进行共培养48小时，可见两种NK细胞的Mn²⁺处理组的细胞毒性均有显著上调，鼠源NK细胞和靶细胞同理可证，即Mn²⁺提高NK细胞的肿瘤杀伤性（Fig. 3A-H）。

3. Mn²⁺通过NK细胞增强CD8+ T细胞的激活

前文提到，Mn²⁺的抗肿瘤效应除了可能依赖于对NK细胞细胞毒性的直接调控外，还可能通过NK细胞进一步调控T细胞。为了验证这种可能性，作者检测了NK细胞去除的小鼠中CD8+ T细胞的激活水平，发现Mn²⁺处理可以让CD8+ T细胞激活水平显著上调但低于对照组（Fig. 1K）。作者分析了CD45+ 肿瘤浸润细胞的单细胞转录组测序（scRNA-seq；测序服务由伯豪生物提供）数据，发现Mn²⁺处理组中NK细胞、CD8+ T细胞及其他一些细胞类型在数目和比例上显著增加，GO和KEGG富集到了NK细胞中趋化因子和白细胞迁移等与表型和功能相关通路的显著激活，随后用体外实验验证了趋化因子浓度在Mn²⁺处理条件下的变化（Fig. 4A-F）。在Mn²⁺处理条件下，CD8+ T细胞和NK细胞共培养时，其激活水平和细胞毒性相比于无Mn²⁺组均有进一步的显著提升（Fig. 4G-L）。综上，作者得到结论：Mn²⁺处理可以通过NK细胞依赖或非依赖的方式调控CD8+ T细胞。

4. Mn²⁺通过cGAS-STING-UTX途径激活NK细胞

cGAS-STING途径在以往的研究中已经被报道受到Mn²⁺调控^[1][2][3]，UTX也被报道在NK细胞响应中具有重要的作用^[4]，而本研究中关于Mn²⁺调控NK细胞的结果也就成为了连接上述两个结论的关键。

首先，作者在STING全身性敲除的小鼠（STING^-/-）中验证了NK细胞的增殖和凋亡都不受Mn²⁺调控，且完全不会被Mn²⁺处理激活；其次，作者在野生型小鼠中分别利用cGAS和STING的抑制剂对cGAS-STING信号通路进行抑制，观察到Mn²⁺处理不会影响NK细胞的增殖，但NK细胞的激活水平不再受Mn²⁺处理的显著上调（Fig. 5）。

最后，为了验证UTX在Mn²⁺依赖的NK细胞激活调控机制中发挥的作用，作者在scRNA-seq结果中通过在转录水平上计算cGAS和STING的表达水平与UTX表达水平之间的相关系数，推断出cGAS-STING通路与UTX具有显著的相关性，并使用TCGA数据库中的公共数据对这一结论进行了验证，随后进一步通过公共数据发现了UTX转录水平和NK细胞丰度之间具有显著的正相关性（Fig. 6A, B）。

Mn²⁺处理能在转录和翻译水平上调UTX，但这种调控在STING敲除的NK细胞中受到明显的抑制（Fig. 6C, D）。在cGAS或STING抑制剂处理的NK细胞中过表UTX可以显著回补激活的NK细胞占比，反之亦然（Fig. 6E-H）。

综上，作者验证了Mn²⁺依赖的cGAS-STING-UTX通路调控NK细胞激活的机制。

参考文献：

[1]. Hooy RM, Massaccesi G, Rousseau KE, Chattergoon MA, Sohn J. Allosteric coupling between Mn2+ and dsDNA controls the catalytic efficiency and fidelity of cGAS. Nucleic Acids Res. 2020;48(8):4435-4447.

[2]. Wang C, Guan Y, Lv M, et al. Manganese increases the sensitivity of the cGAS-STING pathway for double-stranded DNA and is required for the host defense against DNA viruses. Immunity. 2018;48(4).

[3]. Zhao Z, Ma Z, Wang B, Guan Y, Su X-D, Jiang Z. Mn2+ directly activates cGAS and structural analysis suggests Mn2+ induces a noncanonical catalytic synthesis of 2’3’-cGAMP. Cell Rep. 2020;32(7):108053.

[4]. Cheng MI, Li JH, Riggan L, et al. The X-linked epigenetic regulator UTX controls NK cell-intrinsic sex differences. Nat Immunol. 2023;24(5):780-791.