图1 三质粒转染293细胞生产rAAV

图片来源：Mueller C et al., Curr Protoc Microbiol. 2012

Baculovirus/Sf9是一种替代哺乳动物细胞系的rAAV生产方案，该系统利用杆状病毒表达载体（Baculovirus expression vectors, BEVs）感染Sf9昆虫细胞来生产rAAV病毒颗粒。借助Sf9细胞可以大量表达重组蛋白的特点，该系统使用含有rAAV基因组以及AAV-Rep、AAV-Cap基因的昆虫杆状病毒转导Sf9细胞，使rAAV在Sf9细胞中组装，最终达到大规模生产rAAV的目的。

由于Sf9昆虫细胞可以在大规模反应器中高密度悬浮培养，因此该系统更容易放大规模；同时，杆状病毒对于哺乳动物和植物是非致病性的，且采用无血清培养体系，相较依赖质粒转染的293细胞生产系统更为安全。2012年，欧洲药品管理局（EMA）批准的首个rAAV基因治疗药物Glybera正是利用Sf9昆虫细胞生产系统生产的rAAV病毒颗粒。

尽管在过去的10年里，监管部门陆续批准若干基于AAV的基因治疗产品，但该领域仍面临多项挑战，例如rAAV的产量、质量、免疫原性等。2020年9月，Neil G. Rumachik等人在Mol Ther Methods Clin Dev.发表的工作就对293细胞与Sf9细胞的rAAV生产系统差异做了分析。该工作发现，差异主要集中在生产过程中产生的杂质、衣壳蛋白翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs)和体内/体外的感染效率（图2）

图2 Sf9细胞包装系统与293细胞包装系统生产的rAAV差异

图片来源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020

文中明确指出：

1）不同的包装系统生产的rAAV病毒颗粒衣壳具有不同的PTMs，包括糖基化、乙酰化、磷酸化和甲基化（图3）；

2）两个包装系统包装过程中，rAAV基因组均发生甲基化，但两套系统似乎对基因组产生了相反的作用，Sf9细胞生产体系产出的rAAV趋向抑制基因表达，293细胞生产的rAAV出现趋向激活基因表达；

图3 293细胞和sf9细胞平台生产的rAAV衣壳修饰差异

图片来源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020

3）不同系统生产的rAAV的空壳率及杂质也有所差异，293细胞生产的rAAV病毒空壳率显著更低（图3），产生的杂质与包装过程产生的核酸和蛋白质相关；而Sf9细胞系统空壳率相对较高，杂质与内肽酶活性和蛋白质水解有关，此外，杆状病毒系统产生的杂质要么是结构性的，要么是与病毒逃逸有关。

4）另外，293细胞生产的rAAV显现出更强的体内及体外感染能力，研究发现无论是在体内还是体外实验，无论是通过肌肉注射还是通过尾静脉系统给药注射，293细胞生产的rAAV都具有更好的感染能力（图4）。

图4 不同生产体系生产的rAAV在体外及骨骼肌中的感染能力差异

图片来源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020

因此，从这些数据展示可以看到，基于293细胞生产的rAAV可能比Sf9有更好的感染效率、更高的质量，也更有临床应用的潜力。当然，不可否认的是，Sf9系统rAAV包装体系具有更高的rAAV包装产率，假以时日，解决上述问题的Sf9包装系统亦有潜力成为基因治疗载体生产的重要力量。