编者按

 肾脏是人体的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除体内代谢产物及某些废物、毒物，同时经重吸收功能保留水份及其他有用物质，如葡萄糖、蛋白质、氨基酸、碳酸氢钠等，以调节水、电解质平衡及维护酸碱平衡。肾脏同时还有内分泌功能，生成肾素、促红细胞生成素、前列腺素、激肽等，又为机体部分内分泌激素的降解场所和肾外激素的靶器官。肾脏的这些功能，保证了机体内环境的稳定，使新陈代谢得以正常进行。

今天，我们特别关注一项墨尔本默多克儿童研究所研究团队于2023年9月发表在《Nature Protocols》的经典研究——Generation of proximal tubule-enhanced kidney organoids from human pluripotent stem cells，该研究报告了一种用于生成近端小管高成熟度和功能性的肾脏类器官的方法。

文章题目

Generation of proximal tubule-enhanced kidney organoids from human pluripotent stem cells

杂志：Nature Protocols（IF=12.4）

发表时间：2023.9.28

作者：Jessica M. Vanslambrouck, Ker Sin Tan, Sophia Mah & Melissa H. Little等

单位：墨尔本默多克儿童研究所、澳大利亚墨尔本大学等

01、研究背景

人类多能干细胞（hPSCs）定向分化为肾脏类器官，生成具有被基质和内皮细胞包围的节段性肾小管的类器官。但是肾小球形态仍不成熟，鉴于近端小管（PT）在肾小球重吸收和分泌中的独特作用，以及影响着肾脏的整体功能，该结构的不成熟尤其成问题。这种不成熟严重限制了肾脏类器官在药物开发和毒理学研究以及近端小管功能障碍和疾病研究等方面的潜在应用。

在本文中，研究人员详细的描述了一种改进hPSCs肾小球祖细胞的方案，与使用标准肾脏类器官方案生成的肾脏类器官相比，该方案可生成具有细长近端化肾小球的肾脏类器官，并显示出更高的PT成熟度。此外还介绍了一种评估器官组织内PT功能的方法，以及通过免疫荧光观察成熟标志物的方法。

02、研究结果

1. PT增强型类器官方案

研究人员描述了一种PT增强型肾脏类器官的制备方法，该方法通过调整胚胎期间分化阶段的持续时间和维持特定中间状态，促进了肾母细胞的形成。具体来说，通过延长典型WNT信号诱导的时间，并在后续阶段引入FGF9，使得肾母细胞的后中胚层形成更为强健。

此外，通过将单层分化阶段延长至第13天，并使用肾母细胞支持培养基，更好地模拟了肾脏发育过程中的复杂信号环境，从而促进了肾脏类器官的形成。

原文图1 PT增强型类器官方案示意图

2. PT增强型肾脏类器官的形成

与先前的方法相比，该方案的单层分化阶段延长，并且在第13天生成肾脏类器官。分化过程包括使用TeSR-E6和DMEM/F12基础培养基，先后暴露于CHIR99021和FGF9。

从分化的第8到13天，通过添加经过调整以增加BMP7水平的肾小球祖细胞维持培养基，进一步促进肾小球间充质群体的生长。最终的肾脏类器官在第13天生成，并在第27天收集，以最大限度地延长肾脏类器官的成熟时间。

原文图2 hPSC单层细胞和PT增强型肾脏类器官的明场图像

3. PT增强型肾脏类器官的功能和蛋白质表达分析

为确定肾脏类器官的形态和成熟度，在聚合后14 d时固定一部分肾脏类器官，用于PT特异性标记免疫荧光，而其余类器官则用于荧光底物摄取检测。首先进行白蛋白摄取分析，然后进行PT特异性有机阳离子转运分析。

使用激光扫描共聚焦显微镜对两种功能测试中的正常培养类器官以及免疫荧光后固定的类器官进行成像。根据放射状肾小管的存在情况，可以认为PT增强的类器官已培养成功，这些肾小管吸收荧光标记的白蛋白和DAPI（图3），表达PT特异性蛋白（图4），并在其顶端膜上结合莲花四角凝集素（LTL）（图4）。

原文图3 蛋白质吸收和有机阳离子转运PT功能测试的实时共焦图像

原文图4 PT增强型类器官肾小球中蛋白质的表达和定位

4. 该研究的应用和局限性

总的来说，本文的研究结果凸显了PT增强型肾脏类器官模型的潜力，可用于多种应用，包括药物筛选、药效测试、近端小管疾病的治疗方法发现、疾病模型建立、肾脏发育研究以及生物工程方法治疗疾病。然而，PT增强型肾脏类器官仍面临一些限制，例如整体不成熟、无法长期培养以实现结构和功能的成熟、部分重要转运体的低表达水平、向非目标细胞类型分化等。

此外，该模型可能不适用于需要更远端肾单位段的研究方法，并且无法同时在单个分化步骤中产生所有肾脏细胞群，这也限制了肾单位的发育。因此，尽管PT增强型肾脏类器官在肾脏研究领域具有潜力，但仍需要进一步优化以克服这些限制，以实现更广泛的临床和研究应用。

03、编者点评

这是一项非常值得阅读的类器官研究，适合每一位想要开展“PT增强型肾脏类器官相关研究”的学者拜读，文中提出了诱导分化过程中的步骤，培养基配比以及细胞类型的鉴定方法等。其描述的人类PT增强型肾脏类器官模型为药物开发、毒理学研究以及近端小管功能障碍和疾病研究等开辟了道路。

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