我们收集整理了研究人员关于ChIP实验的多个问题，希望对您的研究有帮助。

样品类型

1. 问：如何选择组织样本的 ChIP 实验方案？
答：对于较易处理的组织（如肝脏、脑组织等），用酶解法或者超声法皆可。对于较难处理的组织（如肌肉等），酶解法则不一定总能得到理想结果，此时可以尝试超声法。
对于更特殊的组织，如植物样品、高脂肪含量的组织，可考虑先用特殊方法进行样本处理 [如需要特殊样本处理的操作步骤，请联系技术支持：tech@cst-c.com.cn]，后再利用 SimpleChIP®试剂盒尝试实验。

2. 问：用流式细胞术 FACS 分选后的细胞样品做 ChIP 有什么需要注意的吗？
答：用流式细胞术分选后的细胞样品做 ChIP 很常见。分选必须在交联之前完成。如果细胞样品较多，需要分批进行，导致分选时间太长（长时间分选过程会给细胞造成压力环境）。可以将前批次分选好的细胞先进行交联固定，然后再进行第二轮分选，以得到足够的样品。等所有细胞样品都分选-交联固定好之后，再将所有交联好的细胞合并做后续实验。

流式细胞术中，抗体会结合在细胞表面。这些抗体会被细胞携带到染色质样本中（SimpleChIP® 超声法试剂盒的操作步骤中，部分细胞膜和胞质在染色质片段化超声前已经裂解、弃去了。而酶解法试剂盒方案不会弃去细胞膜。因此超声法试剂盒中存留的分选抗体可能相对于酶解法更少）。因此需要加入足够量的 Protein G 微珠，以避免共沉淀步骤中与 ChIP 抗体结合的固相介质不足。

交联固定

3. 问：是否可用其他交联剂代替甲醛？是否可以用不同交联剂交联两次？
答: 除了甲醛之外，也可以使用 EGS [Ethylene glycol bis (succinimidylsuccinate) ] 等其他在 ChIP 中使用的交联剂。有一些文献发表过两次交联的 ChIP 实验方案：「Cells were washed twice with PBS, and a first cross-link was performed by adding PBS containing 1.5 mM final concentration of EGS. Following 15 min incubation at room temperature with agitation, formaldehyde was added directly to the PBS-EGS at 1% final concentration and cells were incubated at room temperature for 15 min before addition of glycine solution (0.125M final concentration) to arrest the cross-linking reaction. After 10 min incubation at room temperature with agitation followed by washing twice with PBS, cells were scraped in 5 ml of cold PBS and were pelleted by centrifugation at 3,000 rpm for 5 min at 4°C."

两次交联和长时间交联类似，虽然能够增强较弱结合蛋白的 ChIP 效率，但是也可能造成过度交联。过度交联会给样品超声片段化造成麻烦。如果交联过度，可能需要更长时间的超声以达到理想的染色质片段化。如果超声时间过长，同样会影响染色质的稳定性，进而影响 ChIP 效率。也有观点建议洗掉第一轮的交联剂可能会有所改善。

目前，单一使用甲醛做 ChIP 交联的比例应该超过九成。如有必要，可适当增加甲醛交联的时间，应该能与多次交联达到类似效果。CST 目前没有数据能说明两次交联效果优于一次长时间交联。

请注意，仅在组织样本的转录因子、共转录因子的 ChIP 实验中才考虑尝试增强的交联条件。

4. 问：我们医院用多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）储存肿瘤组织样本，是否会被过度交联？
答：不会，多聚甲醛本身不是交联剂，只有在加热或碱性条件下，分解为甲醛后才具有交联效果。储存在多聚甲醛中的组织样本，在染色质制备时，应用 37% 的含甲醇甲醛或 16% 的无甲醇甲醛。

5. 问：在 ChIP 收集细胞的过程中，可以通过胰酶（Trypsin）消化细胞吗？如果可以的话，先固定，后消化？还是先消化，再固定？
答：不建议用胰酶消化，尽量按说明书方案操作。固定之前加胰酶处理，细胞中的信号蛋白会发生一定改变；固定后加胰酶处理，蛋白和核酸结合会受到破坏。因此不建议用胰酶处理。

若实在需要，可考虑尝试固定之后，加入下一步的缓冲液（酶解法：Buffer A；超声法：ChIP Sonication Cell Lysis Buffer），再轻刮细胞，进行后续实验。

片段化：超声

6. 问：影响超声效果的重要注意事项有哪些？
答：首先是样本体积，不能过大。其次是探头位置，需要选择合适大小的超声探头置于样本液面以下接近试管底部几毫米的位置。同时避免碰触管壁或管底，以防泡沫产生，导致超声不均匀或不足。最后是温度控制，每次超声的功率不能太大。单次超声时间不能太长，注意保持冰水浴的低温状态。

7. 问：超声操作方案中什么样的超声仪器最好用？
答：有三种主要的超声仪类型：探头式（接触式）、封闭震荡式 Biorupter（非接触式）、水浴式（非接触式）。根据诸多用户的反馈，Biorupter 相对来说最不适合做 ChIP 超声，因其 DNA 片段化效率低，达到理想片段化的超声时间可能长达 12 分钟，长时间超声可能导致蛋白被破坏。探头式超声仪最便宜，而且 DNA 片段化效率高，因此我们推荐尽可能采用探头式超声仪来做 ChIP 的 DNA 片段化。水浴式（如 Covaris）也能使用，需要根据经验来摸索超声条件。

片段化：酶解

8. 问：酶解法实验操作中，MNase 在 37 度片段化染色质的时候，孵育体系 Buffer B 中没有加入 PIC，目标蛋白是否会被降解？
答：以 CST 的经验来看，尚未碰到 MNase 处理过程中出现蛋白降解问题的先例。首先，MNase 处理染色质仅 20 分钟。其次，Buffer B 中的特定成分（如 DTT 等）也能帮助保护染色质中的蛋白质。

解交联

9. 问：ChIP 洗脱和解交联步骤可以合并进行吗？因为这两步都是在 65 度孵育。
答：不建议将这两步合并。ChIP 洗脱过程中，抗体-染色质复合物会从 Protein G 微珠上洗脱下来，这步在恒温振荡混匀仪（Thermomixer）中以 1,200rpm 左右转速进行，较为剧烈。如果蛋白酶 K 在此时加入，原本共价偶联在微珠上的 Protein G 会被蛋白酶 K 消化，进而相应的降低蛋白酶 K 对抗体-染色质复合物的消化效率。同时，Protein G 上非特异结合的 DNA 也可能被更多的洗脱在溶液中，造成可能的背景信号升高。

10. 问：ChIP 实验解交联步骤中，蛋白酶 K 的处理步骤耗时较长，能否用少于 2 小时？
答：解交联步骤对后续得到 DNA 得率和纯度很关键，为了保证反应充分完全，建议孵育时间不少于 2 小时。

抗体选择

11. 问：IP 级别的抗体能否用于 ChIP 实验？
答：ChIP 实验对抗体的要求高于 IP 实验。若使用未经过 ChIP 实验验证的 IP 级抗体进行 ChIP 实验，可能带来信号过低或背景过高的问题，而对于ChIP后的测序分析，是检测全基因组范围内的结合作用，因而需要更高级别的ChIP-seq抗体，选择如下链接了解更多CST的ChIP-seq验证抗体：https://www.cst-c.com.cn/browse/chromatin-ip-seq?N=4294955758+4294964832+4294956287

检测方法：ChIP-qPCR

12. 问：如何确定目标蛋白与 DNA 的结合位点在哪里？
答：ChIP 实验前，通过生物信息学的方法进行预测（可参考李振亚博士的文档）。在获得 ChIP 阳性结果后可以考虑做预测结合位点的点突变的同时做 ChIP 实验，观察信号是否显著降低，以此来判断 DNA 结合位点。

13. 问：ChIP-seq 与 ChIP-qPCR 检测方法如何选择？
答：ChIP-seq 关注的是基因组或者染色体组上的整体信息，而 qPCR 关注某些基因位点的特定信息。在做 ChIP-seq 之前和之后常常需要利用 q-PCR 进行测试和验证。

检测方法：ChIP-seq

14. 问：ChIP-seq 的 DNA 片段合适大小是多少？
答：根据 ChIP 的实验原理，我们期望获得大小在一个到几个核小体的 DNA（大约 150bp-1kb）。由于目前二代测序平台基本只会测取小于 500bp 的 DNA 片段，所以只要大多数 DNA 片段集中在几百 bp 范围都是适合测序分析的，不需要额外的进行片段大小筛选。

15. 问：ChIP-seq 用 20M 的深度 (75bp x 20M = 1.5 Gb) 对 Input DNA 进行 NGS 测序是否足够？人类基因组有 3 Gb。
答： 为了充分平行对照，在测定 ChIP 后 DNA 和 Input DNA 时需要采用同样的深度。如果用 40M 的深度去测序也是可行的。深度越深，越容易捕获到较弱的结合作用（弱峰）。关于 ChIP-seq 细节的疑问可以参考以下文献「ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia (Genome research, 2012)」。10M 的深度测序在哺乳动物细胞的转录因子 ChIP 中即可接受。

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