活死细菌、细胞检测

-----探寻生命的奥秘

背景介绍

真核生物（哺乳动物细胞）和原核生物（细菌）细胞增殖和细胞死亡间平衡对维持细胞有机的发育与生命的维持至关重要，如果出现失衡将导致各种疾病的发生。活死状态是研究生物增殖生长的常见研究目的，例如；对于真核活死细胞主要通过分析细胞质膜完整性与细胞内酯酶活性，经过特定仪器观察判断，为研究细胞状态提供了一种方便的方法，同时分析活细胞与死细胞，用于评估细胞的活力。可以应用于大多数的真核哺乳动物细胞，但不适用于真菌和酵母。主要对于药物研究、毒性判定、细胞生长状态研究等。

翊圣生物经过匠心研发提供针对真核细胞和原核细胞的双染检测试剂盒，满足您的研究所需。

检测原理

一、 细胞染色

Calcein-AM是一种常用的对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490 nm, Em=515 nm）。 因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein, AM细胞毒性极低，适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此，Calcein-AM常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶（PI）等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545 nm激发，仅可观察到死细胞。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪以及其他荧光检测系统。

二、 细菌染色

荧光染料DMAO是一种绿色核酸荧光染料，可将活细菌和死细菌染色。EthD-III是一种红色核酸荧光染料，仅能对细胞膜受损的死细菌染色。将DMAO和EthD-III混合使用染色时具有完整细胞膜的细菌呈现绿色，而具有受损细胞膜的细菌呈现绿色和红色。结果可以通过荧光显微镜或流式细胞仪来分析，适用于大多数细菌类型。

细菌活力的常见标准是细菌在合适的营养培养基中繁殖的能力，称为生长测定。该试剂盒通常与在液体或固体培养基中的生长测定结果有着很好的一致性。在某些条件下，膜损伤的细菌可能会在营养培养基中恢复并繁殖，而这种细菌在该测定中可能会被认为死亡。相反，一些具有完整膜的细菌可能无法在营养培养基中繁殖，但这些细菌在该测定中可能被认为是活的。因此，如果发现该检测和细菌生长测定之间有相当大的差异，应该考虑上述的可能性。

应用检测

使用结果

1、 细胞染色结果

注：细胞类型=A375胶质瘤细胞，Calcein-AM=2 μM，PI=4.5 μM，染色时间=15min

A为Calcein-AM染色图，B为PI染色图，C为MERGE图

2、细菌染色结果

注：细胞类型=大肠杆菌，EthD-III=2 ul，DMAO=4 ul，染色时间=15min

A为EthD-III染色图，B为DMAO染色图，C为MERGE图

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