大脑对意识的加工依赖于大脑皮层内的活动[1]。其中小鼠皮层可被分为六层，每层都由不同的神经元细胞类型组成，每一层的细胞都参与皮层微环路的形成。每一层内的兴奋性细胞可接受来自同一层内其他兴奋性细胞和抑制细胞的输入[2]。其中L5中的兴奋性锥体神经元(pyramidal neurons，PNs)根据其输出的不同分为三种类型：向其他皮层区域提供远程输出的IT(intratelencephalic)神经元；连接TH和其他皮层下区域的锥体束(PT)神经元和与其他L5 PNs连接的NP（near-projecting）神经元[3]。
所有全身性***均可导致意识丧失[4]。临床上常见的***包括异氟烷（Isoflurane，Iso）、芬太尼-美托咪定-咪达**（Fentanyl-Medetomidine-Midazolam， FMM）和***-甲苯噻嗪（Ketamine-Xylazine ，Ket-Xyl）；虽然这几种***介导麻醉的分子机制不尽相同，但是麻醉诱导的无意识行为和皮层脑电活动的变化是相同的，并在意识丧失时出现，在意识恢复时逆转[5]。除了脑电的变化，fMRI也观察到无意识状态下皮质-皮质和皮质-丘脑联系的断开。在全身麻醉期间，包括L5和L6神经元在内的电特性为长程投射神经元的神经元表现出与脑电图和ECoG观察到的频率变化相关的活动变化[5]。
因为不同类型的神经元在控制皮层微环路中的信息传递有不同的功能，测量单个细胞类型的活动可以更好的了解无意识状态下神经元电活动的相关性。但对麻醉情况下不同神经元的电活动的了解还了解甚少。
最近，来自瑞士巴塞尔分子与眼科研究所的Botond Roska课题组在Neuron发表了题为General anesthesia globally synchronizes activity selectively in layer 5 cortical pyramidal neurons的文章，发现了全身***持续影响小鼠L5椎体神经元自发电活动但不影响其他细胞类型电活动的机制[6]。
01.麻醉引起L5 PNs的同步活动
为了特异性观察L5 PNs的电活动，研究者们使用Rbp4-Cre KL100小鼠，并通过AAV-CAG-FLEX-GCaMP7s记录钙成像。研究者们分别用FMM、Iso和Ket-Xyl三种不同的条件诱导小鼠麻醉，结果发现不论在清醒状态还是麻醉状态，L5 PNs都表现出自发的钙活动（图1C），但与清醒时相比，麻醉状态下L5神经元钙活动的同步性更高（图1D）。尽管在麻醉状态下L5神经元放电频率和振幅也发生了变化，但三种***引起的变化不大一致（图2A-D）。
图1：麻醉状态下L5神经元电活动同步性更高
图2：麻醉状态下L5神经元电活动频率和幅度的变化
02. L5 PNs同步性与意识的丧失恢复有关
接下来研究者们想弄清楚L5 PNs同步性增高的生理意义，于是他们将电活动同步性与小鼠行为（眼睛转动、胡须抖动和身体运动）进行了关联分析。研究结果显示，神经元同步性的转化与小鼠运动行为的转化相关性非常好（R=0.89），统计学分析也证明神经元同步性的转变时间与运动行为的转变时间无显著差异（图3D、H）。
图3：麻醉状态下L5神经元同步性与意识变化相关
03. 神经元同步性增强仅发生在L5 PNs
那么这种神经元同步性的增强是否发生在其他类型的神经元中？接下来研究者们对初级视觉皮层L1，L2/3，L4，L6麻醉后的神经元同步性进行了分析（图4A）。结果发现对于所有被研究的细胞类型，三种麻药引起的麻醉状态下神经元的同步性并不一致（图4B-F）。这说明麻醉引起的神经元同步性变强是L5 PNs特异的。
04. 麻醉时投射至L5 的突触前神经元活动被抑制
为了进一步研究L5 PNs同步性变化的机制，研究者们对L5神经元的输入进行了研究。他们采用PHP.eB AAV-syn-FLEX-splitTVA-EGFP-tTA ，PHP.eB AAV-TREtight-mTagBFP2-B19G 和EnvA-SADDG-GCaMP7s rabies virus联用的双AAV策略实现单突触逆行跨突触的标记（图5A），在感染后5天可观察到L5外的突触前神经元成功表达GCaMP7s（图B）。分别对清醒和麻醉状态下神经元电活动记录发现，这些突触前神经元在清醒时是活跃的，但Iso麻醉引起突触前神经元的活动显著降低（图5C-E）。
图5: L5突触前神经元电活动在麻醉时显著降低
05. L5 PNs在皮质区域的活动是同步的
由于之前的研究只是针对视觉皮层L5进行了成像，为了对整个皮质L5 PNs进行研究，研究者们向Rbp4-Cre小鼠注射AAV-CAG-FLEX-GCaMP7s，并对皮层的一个大区域进行了广域的荧光成像（图6A）。通过对多个挠区清醒和麻醉状态下钙活动的记录，他们发现麻醉的确会导致皮层广泛区域的L5 PNs神经元同步性增高（图6C）。
图6: L5同步电活动出现在多个皮层区域
总之，这项研究揭示了了小鼠L5锥体神经元电活动与麻醉的关系，发现了不同***物引起L5 PNs同步性增强的现象，并且这种高度的神经元同步性在皮层大范围存在。且在进入麻醉状态和从麻醉状态中复苏的过程中，L5 PNs的变化与意识的丧失和恢复相一致。
本文利用钙离子成像等多种AAV，成功研究了小鼠在清醒/麻醉状态下L5 PNs 的电活动。
吉凯基因可为您提供多种AAV产品
定制AAV：过表达/干扰、CRISPR/Cas9（MIT/哈佛大学**授权）、Cre-on/off系统、特异性表达系统。滴度可达1.0E+13 v.g./mL以上
现货AAV ：钙离子成像；光遗传学；化学遗传学；重组酶；荧光对照；顺行逆行神经环路示踪病毒
体内精准靶向研究利器——组织特异性AAV
40+的组织特异性启动子，靶向神经/心血管/肝脏/骨/脂肪/肌肉/视网膜等，实现目的基因体内特异性表达
参考文献…
向上滑动阅览
[1] Brown, R., Lau, H., and LeDoux, J.E. (2019). Understanding the higher-order approach to consciousness. Trends Cogn. Sci. 23, 754–768.
[2] Koch, C., Massimini, M., Boly, M., and Tononi, G. (2016). Neural correlates of consciousness: progress and problems. Nat. Rev. Neurosci. 17, 307–321.
[3] Kim, E.J., Juavinett, A.L., Kyubwa, E.M., Jacobs, M.W., and Callaway, E.M. (2015). Three types of cortical Layer 5 neurons that differ in brain-wide connectivity and function. Neuron 88, 1253–1267.
[4] Hudetz, A.G., and Mashour, G.A. (2016). Disconnecting consciousness: is there a common anesthetic end-point? Anesth. Analg. 123, 1228–1240.
[5] Hagihira, S. (2015). Changes in the electroencephalogram during anaesthesia and their physiological basis. Br. J. Anaesth. 115, i27–i31.
[6] Bharioke et al., General anesthesia globally synchronizes activity selectively in layer 5 cortical pyramidal neurons, Neuron (2022), https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.03.032