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esiRNA:迅速实现基因沉默的新选择

作者:武汉生命之美科技有限公司 2012-05-23T00:00 (访问量:10885)

 

生命之美esiRNA产品介

 

1.      产品描述esiRNA的英文全名是Endoribonuclease-prepared siRNAs,是通过大肠杆菌的RNase III(一种核糖核酸酶)切割长双链RNAdsRNA)而生成的siRNA混合物,长度在18-25bp之间。可以高效敲除靶标基因的表达水平【图1

[1] 生命之美科技有限公司(ABlife)制备的esiRNA进行基因沉默的效果。

 

2.      产品优势

 

l  成功率高(³90%);

l  RNAi效率高(一般均³70%);

l  不需反复摸索,使RNAi更快速简便;

l  最大限度降低脱靶效应,使RNAi结果更可靠;

l  可快速、经济的完成大规模RNAi筛选。

 

3.      产品作用原理RNA干扰(RNAiRNAinterference)是目前所知的、下调靶标基因表达的最有效手段,在科学研究和医药开发方面应用广泛。介导RNA干扰效应的小干扰双链RNAsiRNAsmall interfering RNA)被转染进细胞后,整合到RISC复合体里,其中一条链碱基互定到目标基因的mRNAncRNA上,而RISC复合体里的Argonaute蛋白介导目标RNA,从而达到下调基因表达的目的【图2】。

 

 

【图2

 

4.   同类产品比较和使用建议

 

1)目前用于RNAisiRNA主要分为siRNAshRNAesiRNA三种,其生成和作用机理的异同点见【图2】。

 

l  esiRNA:选定靶标基因200-300bp的区域,通过PCR扩征获得该区域DNA,通过体外转录获得该区的双链RNA,再经过RNase III降解。成一个siRNA库,该库包含该基因区的所有可能siRNAs

l  化学合成siRNAsynthetic siRNA选定靶标基因一个20-22bp的区域,设计小干扰双链RNA的序列,并由化学方法分别合成两条链,在体外退火生成双链RNA,即siRNA

l  shRNAsmall hairpin siRNA选定靶标基因一个20-22bp的区域,设计小干扰双链RNA的序列,两条序列之间由一非配对的单链序列连接,克隆入一个表达质粒中。当质粒转染进入细胞后,转录出来的RNA形成一个发夹环结构(shRNA),类似siRNA初始转录本(pri-miRNA)的结构,该转录本在细胞内经DroshaDicer加工生成成熟siRNA

 

2)化学合成siRNAshRNA共同的天然缺陷。

 

l  首次设计成功率难以保证siRNA-RISC复合物与靶标RNA位点的结合会收到该位点二级结构、以及所结合蛋白质的阻挠[1]。目前mRNA的区域二级结构具有一定预测性,但是蛋白质的结合无法预测。同时,靶标位点的mRNA结构和蛋白质结合情况往往具有细胞特异性。因此,针对一个新基因在一个新细胞系,通常需要设计多个siRNA或者shRNA,才有可能找到一个有效的靶位点,而多数siRNAsshRNA都会以干扰失败告终。

l  脱靶现象(off-target)难以避免。由于这两种方法设计与合成的siRNA对靶标mRNA的识别仅依赖20个左右的碱基配对,而且siRNAmRNA即使是部分配对,也可以通过抑制其翻译等引起表达下调。因此一个下调靶标基因表达的siRNA非常有可能也引发其他拥有相似靶标位点的基因表达,从而干扰结论的可靠性。

 

3esiRNA的天然优势。esiRNA是克服了siRNAshRNA的上述缺点而发展出来的一种高效的RNAi技术[2-4]

 

l  靶标区域长,特异性高,有效避免了脱靶问题。靶标区一般为200-300bp,并且选择在每一个mRNA/ncRNA特异性强的区域。实验证明esiRNA的脱靶几率比化学合成siRNA低一个数量级[3]

l  用上百条siRNA组成的混合库进行RNAi,有效提高了RNAi成功率和效率。200-300bp靶标区经过RNase III消解产生的是针对该靶标区上百条不同的esiRNAs。因此,该靶标区所有不被二级结构或RNA结合蛋白保护的裸露RNA区域均可以被混合esiRNA库里的esiRNAs靶中。

 

4)三种siRNA搭配使用的原则:

 

l  esiRNA适合筛选目的基因使用,价格合理,首次成功率高。用于目的基因筛选,性价比最高。

l  siRNA适合长期使用,针对同一个基因进行系统研究,首次摸索成本高,但是摸索成功后,成本可以有效降低。

l  shRNA适合长期使用,针对同一个基因进行系统研究,首次摸索成本高,质粒构建周期长,但是获得有效的shRNA质粒后,成本有效被降低,重复性好。

l  esiRNA也适合对siRNAshRNA获得的实验结果进行验证,有效避免脱靶效应造成的假象。

 

 

5.   esiRNA的应用举例

 

(1)   全基因组筛选介导特定功能的基因。

 

2002,美国旧金山加州大学的Mike Bishop实验室率先发明了esiRNA技术,并成功验证了该技术对人类多种细胞系及干细胞系中F-luc基因和R-luc基因的抑制作用[4]

2004年,Kittler等使用5,305 esiRNAs来筛选出了37个在HeLa细胞分裂(cell division)中发挥重要功能的基因,包括几个剪接调控因子,文章在Nature上发表[2]。该团队继而对筛选策略进行优化,用esiRNA完成了从17,828个基因中筛选出影响HeLa细胞周期进程以及染色体倍数基因的工作,完成了对人类基因组中通过不同方式影响细胞周期进程的基因,对数百个未知功能基因赋予了细胞分裂的功能,对近千个其他功能基因注释了新功能。论文于2007年发表于Nature Cell Biology[5]

2009年,Cell Stem Cell上有一篇文章报告esiRNAs技术被成功用于从小鼠胚胎干细胞(ESCs)中筛选与Oct4转录因子的调控基因[6]。该研究中使用了25,057esiRNAs,发现296个拥有调控Oct4表达的功能,其中两个基因是Pol II-associating factor 1 complex (Paf1C)的组分。进一步研究表明,Paf1C结合在全能性相关基因的启动子区,对维持干细胞全能性相当重要。

 

(2)   从一类基因中筛选介导特定功能的基因。

 

2009年,Cell上发表的一篇文章成功使用esiRNA59个候选基因中筛选能够显著降低53BP1 focus formation的基因,最终揭示出RIDDLE综合症蛋白在DNA受损位点介导泛素依赖的信号级联放大[7]

2012年,在Molecular Cell上发表的一篇封面文章报道了由生命之美公司参与的一项研究成果,成功使用esiRNA技术从人类基因组所编码的340个潜在RNA结合蛋白中筛选出11个抑制7号外显子剪接的蛋白质,发现了降低hnRNP U表达可以大幅提升SMN2基因7号外显子的剪接效率,有望为脊髓性肌萎缩症的治疗提供新靶点[8]

 

(3)   与化学合成siRNA一起使用,增强结论可靠性。

越来越多的研究发现,siRNA的脱靶现象比较普遍。为了有效避免该现象引起的假阳性结果,许多优秀的研究团队在使用化学合成siRNA对某一个基因的功能进行系统研究时,同时使用esiRNA,以有效增强所获得结论的可靠性[9]

 

 

1.        Kedde, M., et al., RNA-binding protein Dnd1 inhibits microRNA access to target mRNA. Cell, 2007. 131(7): p. 1273-86.

2.         Kittler, R., et al., An endoribonuclease-prepared siRNA screen in human cells identifies genes essential for cell division. Nature, 2004. 432(7020): p. 1036-40.

3.         Kittler, R., et al., Genome-wide resources of endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nat Methods, 2007. 4(4): p. 337-44.

4.         Yang, D., et al., Short RNA duplexes produced by hydrolysis with Escherichia coli RNase III mediate effective RNA interference in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(15): p. 9942-7.

5.         Kittler, R., et al., Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat Cell Biol, 2007. 9(12): p. 1401-12.

6.         Ding, L., et al., A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell, 2009. 4(5): p. 403-15.

7.         Stewart, G.S., et al., The RIDDLE syndrome protein mediates a ubiquitin-dependent signaling cascade at sites of DNA damage. Cell, 2009. 136(3): p. 420-34.

8.         Xiao, R., et al., Nuclear matrix factor hnRNP U/SAF-A exerts a global control of alternative splicing by regulating U2 snRNP maturation. Mol Cell, 2012. 45(5): p. 656-68.

9.         Kolas, N.K., et al., Orchestration of the DNA-damage response by the RNF8 ubiquitin ligase. Science, 2007. 318(5856): p. 1637-40.

 

 

 

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