随着纳米二氧化钛材料 (nTiO2)在各种工业产品中的广泛生产和使用，人们日益关切其对环境造成的潜在的生态和健康风险。研究表明，nTiO2在紫外照射下产生的活性氧对微生物产生不利的生物效应，但也有报道指出，在黑暗中长期接触nTiO2可诱导细菌细胞壁增厚和生物膜形成，促进微生物适应环境。因此，nTiO2对微生物造成何种影响，需要深入而细致的探讨。
2022年3月，来自湘潭大学的张鹏研究团队在Journal of Hazardous Materials （IF 14.224）上发表题为”Quantitative proteomics and phosphoproteomics elucidate the molecular mechanism of nanostructured TiO2-stimulated biofilm formation”的文章，该研究整合蛋白质组学与磷酸化修饰组学探讨微生物适应纳米材料的分子机制。本研究发现，nTiO2显著改变活性污泥中菌群结构，其中大肠杆菌可通过形成生物膜适应亚致死的nTiO2。中科新生命为其提供了蛋白质组学和磷酸化修饰组学技术服务。
研究材料
nTiO2，Escherichia coli K12
技术路线
步骤1：nTiO2选择性富集细菌病原体并增加微生物群落的多样性；
步骤2：nTiO2胁迫下大肠杆菌蛋白质组学及磷酸化修饰组学分析；
步骤3：nTiO2通过增强铁的吸收促进生物膜的生成；
步骤4：nTiO2通过增强转录和翻译过程提高大肠杆菌对抗菌剂适应性；
步骤5：nTiO2通过CsgD的去磷酸化增加了生物膜的生成。
研究结果
1. nTiO2选择性富集细菌病原体并增加微生物群落的多样性
研究人员向活性污泥中分别添加0、5、50 mg/L nTiO2，30h后观察胁迫条件下生物膜的生长情况。结果显示，随着时间的推移，生物膜生物量逐渐增加，并且暴露于nTiO2的活性污泥具有更高的细菌丰度和群落多样性。尤其是一些条件致病菌丰度显著增加，如肠杆菌属、乳球菌属等。总之，nTiO2暴露显著改变了活性污泥中微生物群落结构，促进了生物膜的形成。
图1 nTiO2对活性污泥生物膜形成及菌群丰度的影响
2. nTiO2胁迫下大肠杆菌蛋白质组学及磷酸化修饰组学分析
为了解析nTiO2促进生物膜形成的机制，研究选取大肠杆菌分析了nTiO2暴露引起的蛋白表达及磷酸化修饰层面的变化。蛋白质组学及磷酸化修饰组分别鉴定到2937个蛋白和350个磷酸化肽段和741个修饰位点。GO和KEGG分析显示，上调表达的蛋白中显著富集铁转运和维持铁稳态相关通路，以及核糖体蛋白和RNA聚合酶亚基蛋白。这些结果表明，nTiO2胁迫影响了细菌对铁元素的利用，增强了RNA转录和蛋白翻译过程，可能影响细菌对转录和蛋白质合成抑制类抗生素的耐药性。
图2 不同浓度nTiO2作用于大肠杆菌9h后的多组学分析
图3 nTiO2暴露组与对照组的蛋白调控网络
3. nTiO2通过增强铁的吸收促进生物膜的形成
通过对暴露于50mg/L nTiO2下的大肠杆菌生物膜进行蛋白质组学分析，发现对铁元素有高亲和力的大肠杆菌素合成蛋白以及铁元素转运蛋白表达上调明显，研究者猜测nTiO2促进细菌对铁的利用来增强对环境的适应性。因此，研究人员利用三价铁螯合物来验证铁元素对nTiO2胁迫下生物膜生长的影响。实验表明，外源铁螯合剂干扰了细菌对铁的吸收，破坏了生物膜的发育，这进一步证明了nTiO2通过增强铁的吸收促进生物膜的生成。
图4 nTiO2对微生物铁获取系统的影响
4. nTiO2通过增强转录和翻译过程提高大肠杆菌对抗菌剂适应性
为了深入探究大肠杆菌是否通过调控转录和翻译过程来响应nTiO2胁迫，研究人员在细菌培养基中添加不同类型的转录和蛋白质合成抑制剂，分析nTiO2对大肠杆菌适应性的影响。结果显示，蛋白合成抑制剂四环素处理下的nTiO2暴露组生物膜含量与对照组相当，表明蛋白质合成过程并未参与调控大肠杆菌对nTiO2胁迫下的适应性。而转录抑制剂利福平处理下nTiO2暴露组生物膜含量显著高于对照组，表明nTiO2通过调控转录过程增加大肠杆菌的适应性。nTiO2处理导致利福平的靶标蛋白RpoB磷酸化修饰显著下调，这一调控是nTiO2提高大肠杆菌对转录抑制剂耐药性的主要机制。
图5 大肠杆菌对蛋白质合成抑制剂及转录抑制剂的耐药性研究
5. nTiO2通过CsgD的去磷酸化增加了生物膜的生成
CsgD是已报道的调控大肠杆菌生物膜形成的关键转录调节子，调控胞外多糖、菌毛和纤维素的合成，而纤维素作为线性多糖聚合物，是生物膜形成的重要保护支架。本研究组学结果显示，nTiO2处理诱导CsgD磷酸化修饰水平显著下调，而生物膜合成有关的BcsB、BcsZ、BcsC、SecG和SesY等在蛋白水平显著上调。去磷酸化形式的CsgD可特异性结合到adrA启动子区域并激活器其转录，而通常AdrA通过上调环二鸟苷酸水平介导BcsBAZC等蛋白合成纤维素。总之，nTiO2诱导的CsgD蛋白磷酸化修饰变化，介导了大肠杆菌生物膜形成的调控过程，从而影响大肠杆菌对亚致死浓度的nTiO2适应性。
图6 nTiO2对生物膜基质形成过程中细胞外组分的影响
小编小结
尽管纳米材料和微生物之间的相互作用具有广泛的生态和健康影响，但微生物对纳米材料的适应机制仍不清楚。本研究中，在黑暗条件下暴露于nTiO2的活性污泥中形成的生物膜生物量增加，并选择性地富集病原体。蛋白质多组学分析结果表明，nTiO2胁迫进一步导致条件致病菌的铁载体过表达，通过相关转录翻译蛋白的去磷酸化增强其耐药性。nTiO2会促进生物膜的生成，提高致病菌的适应性，从而会加速生物污染，导致潜在的生态和健康风险。