腋窝淋巴结（LNs）是乳腺癌（BC）的主要转移部位。然而，转移性淋巴结（mLNs）内肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用仍然不清楚。在本文的研究中，我们探讨了mLNs内CD24hiCD27+调节性B细胞（Bregs）对BC细胞耐药性的影响。
2023年10月11日，浙江大学医学院附属第二医院乳腺外科在Clinical Cancer Research杂志上发表了题为CD24hiCD27+Bregs within metastatic lymph nodes promote multi-drug resistance in breast cancer的研究论文。研究揭示了CD24hiCD27+Bregs通过与mLNs内BC细胞相互作用促进耐药性的关键作用，为BC患者使用化疗-免疫治疗联合策略提供了新的证据。
实验收集了接受标准新辅助治疗（NAT）的BC患者的mLN样本，并通过多色免疫荧光染色分析了CD24hiCD27+Bregs的空间分布特征。通过体外实验评价了CD24hiCD27+ Bregs对BC细胞耐药性的影响。使用带有mLNs的小鼠模型评价了阻断Bregs和BC之间相互作用以改善mLNs内肿瘤消退的策略。在接受NAT的BC患者中，活化的CD24hiCD27+Bregs与mLN内残留的肿瘤细胞之间存在密切的空间相关性。
机制上，CD24hiCD27+ Bregs通过分泌IL-6和TNF-a显著增强了BC细胞多药耐药性和类干细胞特征。更重要的是，BC细胞通过CD40L-和PD-L1依赖的近端信号进一步促进了CD24hiCD27+Bregs的激活，形成了一个正反馈模式。PD-L1阻断显著减弱了由CD24hiCD27+ Bregs诱导的BC细胞耐药性，并且在化疗中加入抗PD-L1抗体可以改善mLNs内肿瘤细胞消退。
实验部分
本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光谱组织扫描定量分析系统对来自7个不同患者的BC肿瘤和对照LN的组织切片进行多色免疫荧光图像采集。
Panel 1 : pan-CK，CD19，IL-10，DAPI
Panel 2: pan-CK，CD19, CD24, CD27,IL-10,DAPI
Panel 3 :pan-CK, CD19, TNF-α, IL-6, IL-10, DAPI
为了研究数据的可靠性，本文作者首先通过Tissue Cytometry技术对B细胞分泌IL-10的单细胞表达水平进行了精准定量分析，明确了mLN 中存活的标准 NAT 的残留肿瘤细胞密切相关。为了实现这一目的，免疫荧光染色使用了Panel1：Panel 1 : pan-CK，CD19，IL-10，DAPI。
接下来，为了探讨免疫细胞的活化状态，研究者以在乳腺癌 mLN中的CD24hiCD27+ Bregs作为研究目标，不但对其单细胞表达水平进行了量化，还对其在肿瘤微环境中的分布进行了空间作用关系分析。研究发现，在富含B细胞的淋巴滤泡被破坏， B细胞更多地分布在转移性肿瘤巢周围。在这部分同样借助Tissue Cytometry技术，并使用了Panel2：Panel 2: pan-CK，CD19, CD24, CD27,IL-10,DAPI
在下一步中，研究者对表达IL-10 的B细胞进行研究的基础上，结合表达IL-6和/或TNF-a的细胞亚型，对其与残留肿瘤负荷的关系进行了研究，发现结果呈正相关，从而证明CD24hiCD27+ Breg衍生细胞因子的效应，即TNF-和IL-6，而不是IL-10，是BC细胞干性和多药耐药性的原因。在这部分研究中使用了Tissue Cytometry技术进行分析，使用Panel组合3：pan-CK, CD19, TNF-α, IL-6, IL-10, DAPI
虽然本文大量使用了流式细胞技术与转录组技术对细胞表型及细胞表达水平进行了量化分析，但是在关键数据上，都建立了使用Tissue Cytometry技术作为原位校验方法的验证标准。相比传统的研究思路，这样获得的数据不但更加全面，并且从单细胞蛋白表达层面对空间分布关系进行研究，是最能反映生物体真实情况的研究水平。
在空间距离分析方面，考虑到肿瘤微环境中作用细胞的分布特性，距离肿瘤边界越近相对作用越显著，所以文章作者在考虑微环境作用关系分析方面，在不同测试方案后，采用了距离梯度0-25μm，25-50μm，50-100μm这三个范围，既细化了肿瘤微环境研究的精准性，同时也兼顾远端细胞的数据分析考量。
Figure 1 CD24hiCD27+Bregs是LNS中最主要的B细胞亚群，位于MLN中非常接近肿瘤细胞处。
A: 部分应答（PR，n=17）和进展的转移性淋巴结（MLN）患者的多色免疫荧光图像IL-10（黄色），CD19（红色），pan-CK（绿色）和DAPI（紫色）。根据IL-10和CD19表达的多色免疫荧光图像分析，定量不同药物反应的mLN中IL-10+CD 19+的细胞占比。
F: 在BC患者的非MLN和MLN中的IL-10(黄色)、CD19(红色)、CD24(天蓝色)、CD27(紫红色)、pan-CK(绿色)和DAPI(紫色)染色的多色免疫荧光图像。定量分析IL-10+B细胞中IL-10+CD24hiCD27+B细胞中IL-10+CD24hiCD27+B细胞的百分比。
G: BC患者外周血中IL-10+CD24hiCD27+ B细胞中pan-CK+周围的IL-10+CD24hiCD27+ B细胞占比。
Figure 2 F: 不同处理组小鼠骨髓单个核细胞pan-CK、CD19、IL-10、肿瘤坏死因子-α、IL-6的多色免疫荧光图像。不同处理组小鼠骨髓单个核细胞中IL-10+B细胞占B细胞百分比的统计分析。