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前两期中，我们分别介绍了Orbitrap Exploris™ 480的设计原则和硬件性能，卓越的定性能力，FAIMS Pro可选组件以及对TMT定量的改进。本期，飞飞将为您展示Orbitrap Exploris™ 480最绚烂的一笔——
丰富的定量流程
BoxCar, SureQuant定量流程
随着蛋白质组学的进一步发展，只适用于发现阶段的数据依赖采集模式（Data Dependent Acquisition, DDA; 例如非标记定量，SILAC, TMT, 稳定同位素二甲基标记等定量蛋白质组学方法都属于这一范畴）已经不能完全跟上日益提高的分析需求，尤其是针对临床大队列的转化医学研究。而随后发展的DIA⁽1⁾, PRM⁽2⁾等靶向或者拟靶向技术则进一步填补了基础研究和临床应用的隔阂。
Orbitrap Exploris™ 480对于上述涉及的所有定量方法都给出了非常完善的支持，除此之外Orbitrap Exploris™ 480上的两个新的定量方法也极大的丰富了现有的定量流程。
2018年Matthias实验室在Nature Methods上发表了全新的BoxCar的采集方式（图1）。
图1.BoxCar采集方式示意（点击查看大图）
BoxCar采集方法的核心思想在于一级全扫时采用分段累积，合并扫描的multi-plexing full scan来规避在同一张full scan中高丰度肽段对于低丰度肽段的信号压制，从而提升一级全扫的动态范围和触发二级的灵敏度。
并且借助MaxQuant软件的“Match Between Runs”功能，还可以使用一级质谱feature的精确质核比和保留时间来进行不依赖于二级鉴定的定量模式。BoxCar的采集模式对于动态范围大的样本会有比较显著的鉴定深度优势。Orbitrap Exploris™ 480对于BoxCar的采集模式提供了更好的兼容性，例如将Spectral Multiplexing从10提升至了20, 以支持更为密集的BoxCar隔离窗口。通过对未进行高丰度蛋白去除的血浆样品的分析我们可以看到，采用BoxCar的集采模式相较于传统DDA显著增加了肽段和蛋白的鉴定数量（图2-(a,b,c,d)）。
图2-(a,b,c,d) Orbitrap Exploris™ 480上使用BoxCar DDA模式对血浆样品进行分析（点击查看大图）
SureQuant-超高通量的PRM定量方法
平行反应监控（Parallel Reaction Monitoring, PRM）是Orbitrap系列仪器上的高分辨靶向定量方法，类似于三重四极杆质谱上的选择反应监控（Selected Reaction Monitoring, SRM）,其是进行潜在标志物验证的金标准方法之一。
但是PRM一直受到通量问题的困扰，即使采用动态保留时间，也难以在一针采集中同时监控上百条肽段。因此，在2015年Gallien等人在MCP上发表了Internal-Standard triggered PRM（IS-PRM）的方法，其核心思想为对内标肽段进行一个低分辨，低离子注入时间的PRM扫描（内标的含量通常比较高，因此不会受到灵敏度影响），随后在线对该PRM扫描进行实时谱图检索，若能够匹配到目标序列则触发对应內源肽段的高分辨，高离子注入时间的PRM扫描用于定量⁽⁴⁾。该方法由于需要使用赛默飞提供的API对仪器控制软件进行编程修改，因此一直未能得到广泛应用。
而Orbitrap Exploris™ 480上则提供了商品化的，即时可用的SureQuant定量方法，其核心思想和IS-PRM类似，但是其实现更为巧妙和便捷。SureQuant定量流程巧妙的采用了数据依赖的采集方法来实现IS-PRM相同的功能（图3）。
来看我的新方法
首先我们会进行一个一级的全扫，然后采用inclusion list triggered MS2 来对同位素标记的内标肽段进行二级质谱的扫描（inclusion list中包含了所有需要检测的内标肽段），由于内标肽段通常都以较高的浓度掺入，因此针对内标肽段的二级质谱我们会采用低分辨率和低离子注入时间来进行, 从而尽可能的节省扫描时间。随后我们将采集的内标肽段的二级质谱进行快速的在线谱图匹配，如果能否匹配到目标内标肽段序列则触发一个针对內源肽段的二级质谱扫描（通过精确的mass shift来实现），而內源肽段的浓度通常较低，因此我们采用一个高分辨率，高离子注入时间的二级扫描来尽量提升检测的灵敏度。在SureQuant流程中，我们进行DDA的二级扫描时不设置动态排除，因此內源和内标肽段都可以得到完整的PRM的采集谱图。
图3. SureQuant定量流程示意
举个例子
我们以未进行高丰度蛋白去除的血浆蛋白定量作为一个例子。PQ 500 kit中包含了500个血浆蛋白的重同位素标记内标肽段，总计804条重标肽段，可用于对血浆蛋白进行高通量的靶向定量。采用SureQuant定量流程，我们可以通过70分钟梯度的质谱分析实现每针超过550个內源肽段的定量，并且三针之间的检出重复性非常之高（图4）。定量的动态范围从柱上15 pmol到4amol, 跨度大于6个数量级，并且重复进样体现出了相当高的定量重现性（图5）。
图4. 采用SureQuant定量流程对未进行高丰度蛋白去除的血浆样品进行定量分析（点击查看大图）
图5. 血浆蛋白定量的动态范围和重现性（点击查看大图）
蛋白质组学新高度
经过三期的介绍，我们发现Orbitrap Exploris™ 480质谱仪作为全新一代Q Exactive系列旗舰机型，是一款以高性能，稳定性和耐久性为最主要考量因素的高分辨质谱仪。，其可以满足绝大多数蛋白组学，转化医学和生物制药的分析需求，并且显著提升实验室数据的产出质量和通量。势必将蛋白质组学，尤其是临床蛋白质组学研究推向新的高度。
参考文献：
1.Bruderer, R., et al., Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics, 2015. 14(5): p. 1400-10.
2.Peterson, A.C., et al., Parallel reaction monitoring for high resolution and high mass accuracy quantitative, targeted proteomics. Mol Cell Proteomics, 2012. 11(11): p. 1475-88.
3.Meier, F., et al., BoxCar acquisition method enables single-shot proteomics at a depth of 10,000 proteins in 100 minutes. Nat Methods, 2018. 15(6): p. 440-448.
4.Gallien, S., S.Y. Kim, and B. Domon, Large-Scale Targeted Proteomics Using Internal Standard Triggered-Parallel Reaction Monitoring (IS-PRM). Mol Cell Proteomics, 2015. 14(6): p. 1630-44.
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