在类风湿关节炎(RA)的发病机制中，炎症巨噬细胞的表观遗传调控控制炎症的发生和消退。然而，巨噬细胞介导的关节炎损伤的机制在很大程度上仍然不清楚。本研究发现，在RA患者和实验性关节炎小鼠中，滑膜组织中赖氨酸乙酰转移酶2A (KAT2A)的表达增加与炎症性关节免疫病理密切相关。MB-3 (KAT2A特异性化学抑制剂)可显著改善胶原诱导关节炎模型中的滑膜炎和骨破坏。药理抑制和siRNA沉默KAT2A不仅抑制了先天刺激触发的促炎基因(如Il1b和Nlrp3)的转录，而且在体内和体外也破坏了Nlrp3炎性体的激活。机制上，KAT2A通过抑制NRF2活性及下游抗氧化分子促进巨噬细胞糖酵解重编程，支持H3K9ac，限制NRF2介导的促炎基因转录抑制。靶向KAT2A代表了RA和相关炎性疾病患者的潜在治疗方法。

mRNA-seq

1. 在人和小鼠中，KAT2A表达的增加与关节炎症有关

收集了健康对照、稳定型RA (SRA)患者、活动性RA (ARA)患者的PBMC样本，并分析了KAT2AmRNA的表达情况。RA患者，尤其是ARA患者的KAT2A mRNA水平显著高于健康对照。KAT2A mRNA水平较高的RA患者，IL1B的表达水平也相应较高。通过免疫组化(IHC)进一步分析骨关节炎(OA)和RA样本滑膜组织中KAT2A的表达，直接证实了RA患者炎症膝关节中KAT2A表达升高。

接下来建立了CIA模以评估小鼠滑膜组织中KAT2A表达的变化。随着关节炎的进展，CIA模型滑膜组织样品中KAT2A mRNA和蛋白的表达均显著升高，与人类RA患者的现象一致。关节炎诱导后CIA模型滑膜巨噬细胞中KAT2A的mRNA表达明显增高。此外，KAT2A的表达与关节炎小鼠滑膜巨噬细胞中Il1b的表达和临床评分有很强的相关性。这些数据表明，无论是在RA患者还是小鼠CIA模型中，KAT2A的表达都与关节炎症呈正相关。

2. KAT2A抑制剂改善关节炎的炎症病理

给CIA模型小鼠注射选择性KAT2A酶抑制剂MB-3。MB-3显著抑制炎症性关节炎的发展，治疗小鼠的临床评分较低，关节肿胀较轻。microCT显示MB-3减轻了指指骨和腕关节的骨侵蚀程度，从而改善了骨密度和骨体积。此外，膝关节组织学分析显示，给药MB-3后CIA模型小鼠关节囊肿胀减轻，滑膜增生减轻，膝关节炎症细胞浸润减少。Safranin O染色发现，KAT2A抑制也抑制了CIA小鼠膝关节软骨的破坏。以上数据表明，抑制KAT2A可显著减轻关节炎的病理损伤，提示KAT2A是关节炎的关键致病因子。

3. KAT2A抑制剂抑制CIA模型小鼠炎症和免疫紊乱

免疫失调在很大程度上决定了RA的发病机制。对照组CIA小鼠的病理性脾肿大在MB-3给药后得到改善，这表明KAT2A抑制可能直接影响CIA模型的炎症病。分析了血清中促炎细胞因子的分泌。给药MB-3的CIA小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α浓度显著降低。MB-3处理的CIA小鼠中，CD4+和CD8+高表达CD44的T细胞群减少。CIA模型小鼠发现MB-3给药大大降低了Th1和Th17细胞的频率。在MB-3处理小鼠的脾脏和pln发现Tregs频率增加。KAT2A抑制显著降低了CIA模型小鼠脾脏中 Tfh细胞的数量。KAT2A抑制通过抑制促炎细胞因子的产生和纠正随后的T淋巴细胞失衡来改善RA的免疫损伤。

4. KAT2A抑制剂在体内控制脂多糖(LPS)诱导的全身炎症

通过腹腔注射LPS建立了不依赖于适应性免疫细胞的急性全身炎症模型，LPS触发先天免疫系统，特别是巨噬细胞的激活，包括促炎细胞因子的产生以及炎症细胞的浸润。MB-3预处理改善了LPS诱导的内毒素休克模型肺组织的炎症损伤，改善了炎症细胞浸润和出血的病理改变，MB-3预处理导致内毒素休克模型血清细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α浓度大幅降低。腹腔注射LPS可触发由炎性巨噬细胞及其分泌促炎细胞因子驱动的腹膜炎模型。通过流式细胞术分析腹膜细胞群，发现MB-3预处理抑制LPS小鼠腹腔内F4/80+CD11b+巨噬细胞的浸润。MB-3抑制KAT2A通过调节先天免疫细胞的效应功能，在体内限制LPS诱导的全身性炎症。

5. NLRP3炎性体启动需要KAT2A

通过RNA-seq分析了LPS在DMSO或MB-3处理的小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）中诱导的全局基因表达谱。KAT2A抑制导致促炎基因的大量减少。与DMSO处理的BMDM相比，MB-3处理导致RA功能基因的显著表达差异，这与体内CIA模型的结果一致。MB-3处理介导的差异表达基因也在NLRP3炎症小体通路中富集。KEGG通路显示，上调基因在NF-κB信号、nod样受体信号、细胞因子-细胞因子受体和RA中富集。

MB-3处理抑制LPS诱导的IL-1β和NLRP3基因转录呈剂量依赖性，免疫印迹分析也证实了这一点。MB-3处理也抑制了不同LPS刺激时间下IL-1β和NLRP3 mRNA和蛋白的表达水平。MB-3对IL-6的转录和分泌具有抑制作用，这也证实了RNA-seq的结果。用特异性siRNA沉默KAT2A可显著抑制IL- 1β和NLRP3的诱导表达。为了深入研究KAT2A的功能，利用另外两种KAT2A特异性抑制剂CPTH2和PU139来观察它们对巨噬细胞活化的影响。这两种抑制剂的治疗都抑制了脂多糖诱导的BMDMs中Il1b和Nlrp3的转录，免疫印迹实验也证实了这一点。CPTH2或PU139对KAT2A的药理学抑制也会抑制NLRP3炎症小体的启动。KAT2A通过LPS刺激促进Il1b和Nlrp3的诱导表达，这对于NLRP3炎性小体的体外启动是必不可少的。

6. KAT2A促进NLRP3炎性小体依赖性IL-1β加工

用三磷酸腺苷(ATP)、尼日利亚菌素(Nigericin)和尿酸钠(MSU)等NLRP3炎症小体激活剂处理LPS启动的巨噬细胞，观察KAT2A抑制剂或敲除对NLRP3炎症小体的影响。MB-3处理有效地降低了ATP、尼日利亚菌素或MSU刺激后IL-1β的分泌，但对TNF-α的分泌没有影响。

巨噬细胞中IL-6的分泌也被MB-3处理抑制，以响应LPS启动和ATP、Nigericin或MSU的刺激。KAT2A沉默导致促炎细胞因子如IL-1β和IL-6的产生减少，但TNF-α的产生没有减少。Caspase 1的裂解是炎性小体加工和分泌IL-1β的关键步骤。通过检测培养巨噬细胞上清中caspase 1和IL-1β的蛋白表达，研究了KAT2A对NLRP3炎性体活化的影响。结果表明，MB-3处理可以剂量依赖性地抑制ATP或尼日利亚蛋白刺激后前il -1β和caspase 1蛋白的裂解。M B - 3处理以剂量依赖的方式显著抑制ASC寡聚化。免疫荧光(IF)检测显示，尼日利亚菌素处理LPSprimed巨噬细胞可产生ASC斑点样寡聚物结构，MB-3处理可抑制ASC斑点样寡聚物结构的形成。

7. KAT2A通过抑制NRF2通路支持炎性巨噬细胞的代谢重编程

MB-3处理显著抑制LPS刺激BMDMs的细胞ROS生成。巨噬细胞通过代谢重编程来促进巨噬细胞效应功能，以应对各种炎症刺激。在LPS激活的巨噬细胞中，TCA明显断裂导致线粒体呼吸受损和糖酵解增强。LPS刺激导致ATP和乳酸的产生增加，而MB-3处理则降低了ATP和乳酸的产生，表明LPS触发的线粒体呼吸向厌氧糖酵解的转换受到MB-3的破坏。通过直接测定LPS刺激的巨噬细胞在处理或不处理MB-3的情况下的细胞外酸化率(ECAR)来评估细胞糖酵解水平。结果显示，MB-3治疗显著降低了巨噬细胞的基础和最大ECAR，证实了MB-3治疗后糖酵解水平受。

为了揭示KAT2A对巨噬细胞代谢重编程的潜在机制，重新分析了MB-3或DMSO预处理的LPS活化BMDM的RNA-seq数据，发现差异表达基因在NRF2通路中富集， MB-3处理的BMDM中，许多上调基因与NRF2功能和转录活性相关，与GSEA结果一致。MB-3处理诱导LPS激活的BMDM中NRF2蛋白表达上调。用特异性siRNA在BMDMs中沉默NRF2的表达，然后用MB-3处理NRF2沉默的BMDMs和对照BMDMs，研究NRF2参与IL-1β的转录和蛋白质合成。虽然MB-3对对照BMDMs有明显的抑制作用，但对NRF2沉默BMDMs中NLRP3炎性小体的启动(包括NLRP3)和il -1β前蛋白的合成没有影响。这些结果表明，MB-3对炎症反应的抑制作用依赖于NRF2的上调及其抗炎作用。

8. KAT2A协调组蛋白乙酰化与NRF2转录活性，用于Il1b和Nlrp3转录

分别转染含有Il1b启动子、Nlrp3启动子或Tnf启动子的荧光素酶报告质粒，进行了双荧光素酶报告基因检测。MB-3剂量依赖性地抑制traf6诱导的Il1b和Nlrp3启动子激活，但对Tnf启动子激活影响不大。来自公共数据库的ChIP-seq分析显示，在LPS刺激的巨噬细胞中，NRF2特异性结合Il1b和Nlrp3的启动子，其中NRF2影响H3K9ac水平使用NRF2抗体或H3K9ac抗体进行ChIP-qPCR检测。作为阳性对照，MB-3处理显著促进了Nqo启动子上NRF2的富集。MB-3处理也增强了NRF2对Il1b和Nlrp3启动子的富集，表明NRF2转录抑制因子活性升。同时，使用H3K9ac抗体的ChIP-qPCR结果显示，MB-3抑制KAT2A也降低了Il1b和Nlrp3启动子上的H3K9ac水平，表明MB-3处理介导的转录激活能力丧失。MB-3协调了受抑制的组蛋白H3K9ac修饰和NRF2转录抑制因子活性的增强，以控制Il1b和Nlrp3 mRNA的表达。KAT2A通过抑制NRF2介导的代谢重编程，驱动炎性巨噬细胞NLRP3炎性小体的异常激活和IL-1β的过量产生，导致RA的进行性关节损伤。